• В S. cerevisiae идентифицированы CE/V-элементы по способности плазмиды к сегрегации в митозе
• CE/V-элементы состоят из коротких консервативных последовательностей CDE-I и CDE-III, которые фланкируют регион CDE-II, обогащенный АТ-элементами
Если в сегрегации ДНК участвует центромерная последовательность, то любая молекула ДНК, обладающая такой последовательностью, при митозе должна мигрировать в нужном направлении. Если последовательность отсутствует, то ДНК не способна к сегрегации. Исходя из этого предположения, из дрожжей S. cerevisiae была выделена центромерная ДНК. В отличие от высших эукариот хромосомы дрожжей не содержат видимых кинетохоров, однако делятся при митозе и сегрегируют при мейозе по тому же механизму.
Можно получить плазмиды, которые содержат точку начала репликации и реплицируются подобно хромосомным последовательностям. Однако в митозе и мейозе они нестабильны, и из-за ошибочной сегрегации большинство клеток их выбрасывает. По способности обеспечивать таким плазмидам устойчивость в митозе были выделены фрагменты хромосомной ДНК, содержащей центромеры.
CE/V-фрагмент идентифицируется как последовательность минимального размера, которая при введении в плазмиду обеспечивает ее устойчивость. Еще один способ охарактеризовать функцию таких последовательностей состоит в их модификации in vitro и повторном введении в дрожжевые клетки, где они заменяют соответствующие центромеры хромосомы.
Это позволяет ввести непосредственно в состав хромосомы последовательность, необходимую для функционирования СЕК Фрагмент CEN, полученный из одной хромосомы, может заменить центромеру в другой хромосоме, причем это не сопровождается какими-либо последствиями. Это позволяет предполагать, что центромеры взаимозаменяемы. Они функционируют только в качестве инструментов присоединения хромосом к веретену и не играют никакой роли в обеспечении различий между хромосомами.
Последовательность, необходимая для функционирования центромеры, составляет около 120 пн. Область центромеры устойчива к действию нуклеаз и способна связываться с одной микротрубочкой. Поэтому в центромерной области 5. cerevisiae мы можем обнаружить белки, которые связывают центромерную ДНК, и белки, присоединяющие хромосому к веретену.
В области фрагмента CEN различают три типа последовательностей:
• CDE-I — последовательность длиной 9 пн. Эта последовательность, незначительно варьируя по составу, присутствует на левой границе всех центромер.
• CDE-II — последовательность длиной 80-90 пн, более чем на 90% состоящая из АТ-блоков и обнаруженная во всех центромерах. Функции этой последовательности определяются длиной, а не нуклеотидным составом. По структуре она приближается к коротким тандемным повторам (сателлитным) ДНК.
• CDE-III последовательность длиной 11 пн, которая высококонсервативна и обнаруживается на правой границе всех центромер. Последовательности, расположенные по сторонам этого фрагмента, менее консервативны и, возможно, также необходимы для функционирования центромеры.
Мутации в CDE-I и в CDE-II приводят к частичной утрате функции центромеры, однако точечные мутации в центральной CCG области последовательности CDE-III полностью лишают центромеру ее функции.
Поиск гомологии между элементами CEN дрожжей позволил идентифицировать три консервативных последовательности.