Тест флюоресцентного пятна (Beutler) при недостатке ферментов в эритроцитах
Тест флюоресцентного пятна (Beutler) основывается на следующие соображения. Способы количественного определения ферментов в эритроцитах относительно сложные и требуют дорогостоящей аппаратуры. К тому же не всегда необходимо точное определение степени дефицита, достаточно установить имеет ли последний какое-либо клиническое значение, выражающееся неспособностью окислять или восстанавливать пиридиннуклеотиды в показательной пропорции.
Сокращенные дефициты не представляют значения и не ставят каких-либо гематологических вопросов носителям. Вот почему были развиты тесты, зависящие от реакции пиридиннуклеотидов, которыми темпы окисления восстановления соединений измеряются не спектрофотометром а флюоресценцией, наблюдаемой невооруженным глазом, излучаемой лишь восстановленными пиридин-нуклеотидами (у окисленных не отмечается). К каждому из этих тестов добавляется в смесь реагентов проба подлежащей исследованию крови, образуется пятно на бумаге Ватмана № 1.
Высохшие пятна рассматриваются при ультрафиолетовом свете, излучаемом обычной лампой в близкой ультрафиолетовой области.
Определение Г-6-ПД способом флюоресцирующего пятна. Отобрать кровь на гепарине, ЛКЦД или ЭДТА. Добавить 16 микролитров крови на 100 микролитров смеси, содержащей следующие ингредиенты: 100 мкл Г-6-П 0,01 мМ; 100 мкл НАДФ 7,5 мМ; 200 мкл 1% раствора сапонина; 300 мкл буфера трис НСl 750 мМ, при показателе водорода 7,8; 100 мкл GSSG 8 мМ; 200 мкл дистилированной воды. Нанести первое пятно на фильтровальную бумагу Ватмана № 1, подождать 5—10 мин и нанести второе пятно.
При пробах в норме (когда эритроциты содержат достаточное количество Г-6-ПД) первое пятно излучает слабую флюоресценцию, в то время как второе — резкую. Когда отсутствует Г-6-ПД флюоресценция не наблюдается. Одновременно с исследованием предполагаемой патологической крови, исследовать также пробу нормальной крови.
Отождествление ПК способом флюоресцирующего пятна. Поскольку лейкоциты лиц с дефицитом ПК в эритроцитах могут иметь нормальную концентрацию этого фермента (отмеченные два вида ферментов отражаются разными генами) процентрифугировать пробу крови и удалить слой лейкоцитов, при этом гемолиз осуществляется не посредством каких-либо литических факторов вида сапонина, а гипотонией. Таким образом большинство лейкоцитов остаются неповрежденными и не влияют, своим содержанием ферментов, на изменение условий реакции.
Добавить 10 мкл 20% взвеси эритроцитов в физиологическом растворе на 100 мкл смеси, содержащей следующие реагенты: 30 мкл (нейтрализованного) фосфо-энолпирувата 0,15 М; 100 мкл АДФ 30 мМ (нейтрализованного); 100 мкл (нейтрализованного) НАДФ 15 мМ; 100 мкл MgCl2 80 мМ; 50 мкл буфера КРО4 0,25 М, при показателе водорода 7,4; 620 мкл дистилированной воды. Нанести одно пятно из смеси, после добавления взвеси эритроцитов и осуществления гемолиза, остальную часть смеси подвергнуть 30-минутной инкубации, при температуре 37°С. Из этой последней смеси наносится второе пятно.
Фильтровальная бумага, на которую нанесены пятна, рассмотреть при ультрафиолетовом свете. Нормально (при наличии ПК) первое пятно излучает резкую флюоресценцию, что не обнаруживается во втором пятне, поскольку во время инкубации НАДФ был подвергнут окислительному процессу и утратил способность реагировать, посредством флюоресценции, на ультрафиолетовый свет. Когда исследуемые эритроциты не содержат ПК флюоресценция наблюдается и во втором пятне.
