Нечувствительность к гливеку хронического миелолейкоза. Причины резистентности
С появлением в лечении больных хроническим миелолейкозомгливека достигнуты огромные успехи, однако проблему лечения этого заболевания нельзя считать решенной. К настоящему времени более 20 000 больных в различных стадиях хрронического миелолейкоза получили лечение гливеком. Накопленный опыт показал, что, несмотря на констатацию полной цитогенетической ремиссии, очень часто, а возможно никогда, не достигается полная эрадикация патологического клона. A. Hochhaus и соавт. неоднократно на протяжении 15 мес с помощью РВ-ПЦР обследовали 55 больных с полной гематологической и цитогенетической ремиссией, продолжавших ежедневно получать гливек в полной дозе. Все эти больные оставались BCR-ABL-позитивными. Аналогичные результаты получены австралийской группой. С помощью количественной полимеразной цепной реакции на протяжении 18 мес обследовали 55 больных, из них 28 больных получали гливек, 27— ИФН-а и Ara-C.
Полная цитогенетическая ремиссия получена у 21 больного в группе леченных гливеком и лишь у 11 получавших ИФН-а и Ara-C. Уровень транскрипта BCR-ABL был достоверно ниже после лечения гливеком, но лишь у 2 больных его не удалось обнаружить. Сохранение резидуального BCR-ABL-позитивного клона у больных с полной цитогенетической ремиссией после терапии гливеком подтверждено рядом работ, хотя всегда обнаруживается восстановление поликлонального гемопоэза и значительное уменьшение величины лейкемического клона, при этом достоверно большее, чем у больных с полной цитогенетической ремиссией после терапии ИФН-а.
Исследование причин сохранения BCR-ABL-позитивного клона показало, что существуют различные механизмы, определяющие нечувствительность лейкемических клеток к гливеку. Оказалось, что покоящиеся предшественники гемопоэза нечувствительны к гливеку in vitro. Это согласуется с недавно опубликованными данными о том, что при сохранении полной цитогенетической ремиссии и продолжении при этом лечения гливеком в течение 2 лет у всех больных, обследованных с помощью высокочувствительной техники (real-time quantitative PCR и nested PCR assay), удалось обнаружить сохранение BCR-ABL-позитивных CD34+-клеток. На основании результатов использования современной техники определения резидуального клона BCR-ABL-позитивных клеток предлагается даже исключить термин «полная молекулярная ремиссия» для ХМЛ, а говорить о «неопределяемом в данный период времени транскрипте».
Число BCR-ABL-позитивных CD34+-клеток в культуре клеток от больных хроническим миелолейкозом уменьшается при лечении гливеком, и это уменьшение имеет дозозависимый характер.
Наиболее частыми причинами нечувствительности части BCR-ABL-позитивных клеток к гливеку являются повышенная экспрессия гена BCR-ABL в результате его амплификации и точечные мутации в киназном домене ABL-тирозинкиназы, препятствующие ее связи с гливеком. Амплификация гена BCR-ABL с образованием множества копий и увеличением экспрессии его транскрипта в 10—15 раз встречается примерно у 18—20 % больных, с самого начала резистентных к гливеку, или при появлении BCR-ABL-позитивных клеток после полной цитогенетической ремиссии. Иногда при этом обнаруживаются добавочные аберрантные Ph-хромосомы.
При точечных мутациях в результате замены одного нуклеотида происходит замена одной аминокислоты на другую в АТФ (и гливек)-связывающем участке ABL-тирозинкиназы. Это ведет к изменению пространственной структуры тирозинкиназы и невозможности связывания гливека. Первой из описанных и наиболее частой из точечных мутаций является замена цитидина на тимин в позиции 315 молекулы тирозинкиназы. В результате этой замены треонин превращается в изолейцин. ABL-тирозин-киназа связывается с гливеком через водородную связь, для осуществления связи необходим атом кислорода, обычно доставляемый треонином.
В изолейцине атома кислорода нет, поэтому связь ABL-тирозинкиназы с гливеком оказывается невозможной. В культуре клеток, полученных от больных хроническим миелоидным лейкозом, более чем 20-кратное повышение концентрации гливека по сравнению с той, которая подавляет активность ABL-тирозинкиназы дикого типа, не снижало активности ABL-тирозинкиназы с заменой треонина на изолейцин в АТФ-связывающем домене. У 60 % больных, резистентных к гливеку, обнаруживают точечные мутации в одном из трех важнейших районов BCR-ABL-тирозинкиназы: в терминальном, содержащем аминокислоты, которые формируют петлю из нуклеотидов для связывания АТФ; каталитическом домене, куда непосредственно встраивается гливек, и в терминальном карбоксильном участке, непосредственно контролирующем активность каталитических процессов в клетке.
Замена треонина на изолейцин встречается примерно у трети больных с данным механизмом резистентности, однако описано около 30 других мутаций (например, замена треонина на гистидин или глутамина на лизин или валин), наличие которых также обусловливает резистентность к гливеку.
Эти мутации у большинства больных до лечения гливеком не определяются или определяются в очень небольшом количестве клеток. Очевидно, терапия способствует отбору клеток с мутациями, имевшихся до лечения или появившихся в период его. Это показывает, что нерационально применять сниженные дозы препарата, лучше делать перерывы, тем более что уже описано восстановление утраченной чувствительности к гливеку в некоторых случаях после перерыва в терапии.
Анализ частоты мутаций в ABL-домене тирозинкиназы в различных стадиях хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) у большой группы больных показал, что мутации значительно чаще наблюдаются в продвинутых стадиях болезни. В стадии акселерации они обнаруживаются у 33 % больных, в поздней хронической стадии — у 22 % и не выявляются в ранней хронической стадии болезни. У 89 % больных с мутациями зарегистрирована резистентность к гливеку. Мутации были очень частыми у больных, утративших со временем большой цитогенетиче-ский ответ. Установлено, что при лечении гливеком мутации накапливаются с течением времени: они обнаружены у 41 % больных, лечившихся более 4 лет, и лишь у 9 % получивших препарат менее 4 лет.
Не все мутации в молекуле BCR-ABL-тирозинкиназы приводят к потере чувствительности к гливеку. Мутации в позициях 315, 253, 255 и 351 молекулы тирозинкиназы оказываются критическими и всегда сопровождаются потерей чувствительности к гливеку, поскольку располагаются в районе связывания с АТФ и, следовательно, с гливеком. В то же время ряд других мутаций, располагающихся вблизи района связывания, снижают чувствительность к гливеку, но это снижение можно преодолеть, увеличивая дозу препарата.
Иногда при лечении гливеком со временем появляются добавочные хромосомные изменения. Они могут стать причиной включения иных, независимых от активности тирозинкиназы механизмов клеточной пролиферации или уменьшения апоптоза, например в связи с выключением генов-супрессоров (снижение активности гена ТР53 при изменении длинного плеча хромосомы 17). Описано развитие резистентности к гливеку в результате появления аберрантного белка bcr-abl, обусловленного включением в ген BCR-ABL добавочного, «вставного», домена другого гена.
С помощью олигонуклеотидных микрочипов выявлена и другая возможная причина резистентности или слабой чувствительности к гливеку. Изучение экспрессии более 12 000 генов у 53 больных позволило выделить набор из 31 гена, экспрессия любого из них сочеталась с отсутствием полной цитогенетической ремиссии. Часть этих генов связана с адгезией, пролиферацией и апоптозом. Возможно, в таких случаях активируются другие пути клеточной пролиферации, чем обычные при хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ), независимые от активности ABL-тирозинкиназы.
Наконец, исследован еще один механизм возможной резистентности к гливеку, главным образом в стадии акселерации и бластного криза. Показано, что в острой фазе хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) в плазме появляется а,-кислый гликопротеин (AGP), который легко связывается с гливеком, препятствуя его связи с ABL-тирозинкиназой.
В снижении чувствительности к гливеку может иметь значение повышение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости MDR1. Известно, что гливек связывается с продуцируемым этим геном Р-гликопротеином (Pgp) — белком, выполняющим в клетке функцию выведения проникших через мембрану чужеродных веществ, в том числе лекарственных средств. Показано, что клетки больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ), экспрессирующие ген MDR1 в культуре, нечувствительны к гливеку и концентрация гливека в таких клетках в 3—24 раза меньшая, чем в клетках, не экспрессирующих MDR1. Неясно, во всех ли случаях сохранения BCR-ABL-позитивных клеток неизбежен рецидив заболевания.
Обнаружение таких клеток у здоровых лиц в значительно большем числе случаев, чем частота заболеваемости хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ), показывает, что возможно длительное существование этих клеток без клинического развития болезни. Возможность длительного персистирования патологического клона без клинической манифестации рецидива наблюдали у больных ОМЛ с t(8;21), у которых клон клеток с этой транслокацией определялся после 10 лет полной клинико-гематологической ремиссии. Известно, что в периоде полной клинико-гематологической и цитогенетической ремиссии в организме больного может сохраняться различное количество лейкемических клеток, в том числе достаточно большое — до 1010. Очевидно, длительность безрецидивного периода должна зависеть как от числа сохранившихся патологических клеток, так и от их способности пролиферировать и подвергаться апоптозу.
