Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Количественное определение ферментов в эритроцитах - методика, показатели нормы

Исследование ферментов улучшилось в связи с развитием физико-химической методологии и ее применения в клиническом исследовании.

В настоящее время располагаем значительным числом способов, различной чувствительности, требующих более или менее сложные технические условия для их проведения. Они способствуют определению наличия ферментов в эритроцитах, оценке активности и выявлению типа и структурной разновидности значительного числа таких протеин.

Активность фермента определяется измерением, в определенный интервал времени, колебаний концентрации субстрата, на который он воздействует. Активность выражается международной единицей. По определению международная ферментативная единица соответствует той активности, которая вызывает преобразование 1 микромоля специфического субстрата, за 1 минуту при стандартных условиях показателя водорода, температуры, концентрации субстрата и кофакторов. Активность относится к концентрации гемоглобина (в %).

Большинство методов определения ферментов в эритроцитах основываются на колебаниях оптической плотности пиридиновых нуклеотидов (НАДФ и восстановлен. НАДФ), наблюдаемой при 340 нм и вызванной воздействием фермента на субстрат. При этих реакциях НАДФ и восстановлен. НАДФ представляют собой акцептор/донор ионов водорода, подвергающихся процессу окисления/восстановления.

Помимо методов прямого определения концентрации ферментов можно проводить и тесты отбора, точность которых достаточно хорошая. Существуют также косвенные тесты исследования способности эритроцитов реагировать на усиленные запросы.

Метаболизм эритроцитов - последствия энзимопатий, недостатка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД)
Метаболизм эритроцитов - последствия энзимопатий, недостатка глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД)

Количественное определение ферментов в эритроцитах

Принцип количественного определения ферментов в эритроцитах. В буфере, с соответствующим исследуемой области показателем водорода приготовить смесь реагентов, в состав которой входит достаточно большое количество специфического субстрата, коферменты и ионы магния. Добавить гемолизат, приготовленный в стандартных условиях, в котором содержится исследуемый фермент. Концентрация последнего непосредственно определяет пропорцию окисляемого или восстанавливаемого кофермента (пиридин-нуклеотид). Колебание оптической плотности смеси, при длине волны 340 нм, способствует исчислению количества фермента в объеме использованного гемолизата.

Приготовление гемолизата для количественного определения ферментов в эритроцитах. Отобрать кровь на противосвертываю-щем веществе (ЭДТА, ЛКЦД, гепарин, раствор Альсевера). Сохранять при температуре 4 С. Большинство эритроцитных ферментов устойчивы несколько дней, когда отбор и хранение проводятся правильно. Тем не менее рекомендуется обрабатывать пробы в день их отбора. Отделять эритроциты от плазмы и лейкоцитов центрифугированием на холоде. Надосадочная масса и buffy-coat отсасываются. Массу эритроцитов промывать холодным физиологическим раствором. Расплавление крови вызвано добавлением 19 объемов гемолизирующего раствора к 1 объему эритроцитов (см. список реагентов). Взболтать, процентрифугировать на холоде (10 мин. при 5000 об.). Определить концентрацию гемоглобина в гемолизате.

Реагенты количественного определения ферментов в эритроцитах:
1) Буфер трис-HCl, рН 8,0. Отвесить 12,1 г. трис и растворить в примерно 80 мл дистилированной воды. Добавить концентрированную HCl, покапельно, до достижения рН 8,0. До 100 мл добавить дистилированной воды. Хранить при 4°С.
2) Раствор 0,1 М MgCl2. Растовить 2,0 г MgCl2 в 100 мл дистилированной воды. Раствор весьма устойчив. Хранить на холоде.
3) Раствор глюкозо-6-фосфат (субстрат). Отвесить 21,7 мг двунатриевой соли Г-6-Ф-3Н20, растворить в 10 мл дистилированной воды. Получим раствор 6 мМ Г-6-Ф, долго устойчивый при условии хранения на холоде.

4) Раствор НАДФ. (TPN) (кофермент). Отвесить 1,7 мг однонатриевой четырехводной соли НАДФ, расворить в 1 мл дистилированной воды; получим раствор 2 мМ, устойчивый при температуре 4°С.
5) 1 М раствор КС1. Отвесить 7,5 г КС1 и растворить в 100 мл дистилированной воды. Раствор весьма устойчив на холоде.
6) 2 мМ раствор НАДвосст. Растворить примерно 2 мг восстановленного НАД в 1 мл дистилированной воды. Раствор должен быть свеже приготовленным.

7) Раствор лактикодегидрогеназы. Имеющийся в торговле раствор разбавить с таким расчетом, чтобы концентрация полученного раствора равнялась 60 единицам на 1 мл. Рабочий раствор приготовлять ежедневно. Устойчив 8 часов при температуре 4°С.
8) Раствор фосфоэнолпирувата. Отвесить достаточное количество фосфоэнолпирувата для приготовления 0,015 М раствора. Развести в соответствующем объеме воды и привести к водородному показателю 7—8, используя для этого 0,2 М раствор NaOH. Раствор очень устойчив, когда сохраняется путем свертывания.
9) 4 мМ раствор АДФ с водородным показателем 7. В случае использования чистого вещества необходимы 17 мг на 10 мл раствора. При температуре 4°С раствор устойчив несколько месяцев.
10) Гемолизирующий раствор. 0,5 мл бетамеркаптозтанола довести до 1 л дистилированной воды, вместе с 10 мл 0,27 М нейтрализованного ЭДТА и 5 мл из 2 мМ раствора НАДФ. Смесь устойчива неделю при температуре 4°С.

В принципе рекомендуется использование баков вместимостью 1 мл, при этом отмечаем, что указываемые ниже объемы для количественного определения Г-6-ПД и ПК расчитаны на подобные баки. При использовании баков другой вместимости умножить объемы отмеченных реагентов на фактор 2 или 3.

В целях определения концентрации Г-6-ПД в эритроцитах приготовить смесь из следующих ингредиентов (объемы даны в микролитрах): 100 раствора трис-НС1; 100 раствора MgCl2; 100 раствора НАДФ; 580 дистилированной воды; 20 гемолизата и 100 Г-6-фосфата (соблюдать указанный порядок). Длительность реакции 10 минут (между первым и вторым прочетом с помощью спектрофотометра, при длине волны 340 нм).

Для определения концентрации ПК в эритроцитах перемешать следующие ингредиенты (объемы даны в микролитрах): 100 раствора трис-НС1; 100 раствора KG; 100 раствора MgCl2; 100 раствора восст. НАД; 100 раствора АДФ: 280 дистилированной воды; 20 гемолизата; 100 лактикодегидрогеназы; 100 PEP. Прочет результата реакции проводить также при 340 нм в течение произвольно установленного времени — 10 мин. В отличие от Г-6-ПД оптическая плотность смеси для определения ПК уменьшается по мере того, как восстан. НАД подвергается процессу окисления.

Исчисление результатов, нормальные значения ферментов в эритроцитах. Формула, по которой определяется концентрация описанных выше ферментов в эритроцитах (Г-6-ПД и ПК) для отражения в международных единицах, следующая: МЕд/ Гб = ΔОП х 105 / (6 х 22 х Гб х Об),

где: ΔОП колебание оптической плотности смеси за одну минуту; 6,22 коэффициент миллимолярного гашения восстан. НАД или НАДФ; Гб отражает концентрацию гемоглобина в гемолизате, выраженную в г %; Об представляет собой объем гемолизата, добавленного к 1 мл реактивной системы, выраженного в микролитрах.

Нормальная концентрация Г-6-ПД в эритроцитах равняется 6,63 ± 1,10 MEд на г. гемоглобина. В ретикулоцитах содержится большее количество Г-6-ПД, по сравнению со зрелыми эритроцитами в норме и во всех случаях завышенных значений при ретикулоцитозе необходимо провести повторное определение концентрации ферментов. При наличии гипохромной анемии значения Г-6-ПД также могут оказаться завышенными, поскольку относятся к меньшей концентрации гемоглобина. В зрелых эритроцитах нормальная концентрация ПК равняется 5,38 ± 1,67 МЕд/ г. гемоглобина.

- Читать далее "Тест восстановления метгемоглобина (метод Brewer) при недостатке ферментов в эритроцитах"


Оглавление темы "Лабораторная диагностика в гематологии":
  1. Тест сиклизации гематий при гемоглобине S - методика проведения
  2. Тест тепловой неустойчивости гемоглобина - методика, показатели нормы
  3. Методика выявления телец Гейнца
  4. Тест на выявление телец включения гемоглобина Н
  5. Спектральное исследование крови для диагностики врожденной метгемоглобинемии - гемоглобина М
  6. Количественное определение ферментов в эритроцитах - методика, показатели нормы
  7. Тест восстановления метгемоглобина (метод Brewer) при недостатке ферментов в эритроцитах
  8. Тест флюоресцентного пятна (Beutler) при недостатке ферментов в эритроцитах
  9. Тест на осмотическую резистентность эритроцитов - методика, показатели нормы
  10. Тест аутогемолиза эритроцитов - методика, показатели нормы
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта