Метод биочипов (DNA microarray) в диагностике генетических мутаций: принципы, возможности
Секвенирование генома человека и создание библиотеки кДНК сделало возможным синтез праймеров и индикаторных зондов, комплементарных к любой последовательности ДНК, и анализ экспрессии множества генов. Благодаря этим возможностям создан быстрый и эффективный метод биочипов (DNA microarray), который позволяет анализировать дифференциальную экспрессию тысяч и десятков тысяч генов одновременно.
На стеклянные пластинки размером 1 см2 (чипы) наносят амплификаты тканевой мРНК в нескольких разных разведениях и меченные флюоресцентной меткой индикаторные ДНК-зонды, комплементарные всем интересующим последовательностям ДНК. После гибридизации на чипе проводят точное измерение дифференциальной экспрессии генов по сравнению интенсивности флюоресценции с контрольными образцами определенной концентрации.
Этот метод в модифицированном виде используется для сравнения профилей генной экспрессии в различных образцах, например в опухолевой и соответствующей нормальной ткани. На чип точечно наносят ДНК-зонды, комплементарные интересующим последовательностям ДНК. Выделенную из экспериментального образца тотальную тканевую мРНК амплифицируют в ретротранскриптазной ПЦР и метят ее во время обратной транскрипции (синтеза ДНК по РНК-матрице) красным флюорохромом.
Затем меченый амплификат смешивают с амплификатом сравниваемого образца, меченным в параллельной реакции зеленым флюорохромом. Полученную смесь наносят на биочип, где амплификаты гибридизуются с иммобилизованными в определенных точках чипа индикаторными зондами.
В результате получают соотношение интенсивности двуцветной флюоресценции для каждого элемента (гена), соответствующее тому образцу, в котором данный элемент (ген) экспрессируется активнее. В настоящее время разрабатываются коммерческие образцы биочипов с минимизированным количеством маркеров для диагностических целей.