Гематология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Гематология:
Гематология
Физиология крови
Методы исследования
Анемии
Острые лейкозы
Миелодиспластические синдромы (МДС)
Хронические лейкозы
Лимфомы
Гистиоцитозы - гистиоцитоз Х
Макроглобулинемии
Коагулопатия
Патология тромбоцитов
Переливание крови
Трансплантация стволовых клеток
Книги по гематологии
Иностранные книги по гематологии
Рекомендуем:
Остальные разделы:
Абдоминальная хирургия
Анатомия человека
Акушерство
Биология
Генетика
Гепатология
Гигиена труда
Гинекология
Гистология
Дерматология
Оз и Оз
Кардиология
Лучевая медицина
Микробиология
Неврология
Неотложная хирургия
Отоларингология
Офтальмология
Профилактика заболеваний
Психология
Пульмонология
Физиология человека
Скорая помощь
Стоматология
Топографическая анатомия
Травматология
Фармакология
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Алгоритм иммунодиагностики гемобластозов

При проведении иммунодиагностики гемобластозов устанавливают иммуноподвариант заболевания (в рамках морфоиммунологического диагноза), оценивают степень распространенности процесса (лейкемизация, поражение костного мозга), констатируют наличие или отсутствие минимальной резидуальной болезни.

В отличие от солидных опухолей гемобластозы являются системными заболеваниями, происходящими из клеток гемопоэтической ткани со всеми присущими этим клеткам свойствами. Лимфомные клетки, так же как и нормальные лимфоциты, легко поступают в кровеносное русло, способны циркулировать в крови и заселять любые участки организма человека. По этим причинам многообразны объекты иммунологического (и, разумеется, морфологического) исследования при диагностике гемобластозов. Объектами иммунологического исследования являются как клеточные суспензии (кровь, костный мозг, цереброспинальная жидкость, экссудаты в серозных полостях), так и биопсийный материал опухолевой ткани.

В ряде случаев (особенно при острых лейкозах и хроническом лимфолейкозе/лимфоме из малых лимфоцитов) именно клетки крови или костного мозга являются наиболее доступным объектом для иммунологического исследования. Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала опухоли при лимфомах целесообразно дополнять иммунологическими методами, позволяющими эффективно изучать суспензии клеток.

При исследовании клеточных суспензий основным методом иммунологического анализа является проточная цитофлюориметрия. Современные возможности этого метода поистине велики. Они позволяют проводить двух-, трех- и даже четырехмерное иммунофлюоресцентное исследование на уровне одной клетки. При анализе острых лейкозов и лимфом с выраженным лейкемическим компонентом (например, лимфоме из малых лимфоцитов/хроническом лимфолейкозе, ХЛЛ) в этом, как правило, нет необходимости: популяция клеток гомогенна и маркерный профиль опухолевых клеток очевиден.

Иная ситуация при обнаружении той или иной пропорции лейкозных/лимфомных клеток среди нормальных клеток крови или костного мозга. В этих случаях необходимы идентификация опухолевых клеток на основе их линейной принадлежности (Т- или В-линия) и последующий анализ клональности или дифференциально-диагностических маркеров. Подобный анализ требует одновременного исследования 2 или 3 антигенов на мембране клетки с использованием прямых конъюгатов моноклональных антител с различными флюорохромами.

Иммунодиагностика гемобластозов
Гомогенная популяция лимфоцитов крови при хроническом лимфолейкозе. Непрямое иммунофлюоресцентное окрашивание, проточная цитометрия на приборе FACScan.
а — светорассеяние лазерного луча: мономорфная популяция лимфоидных клеток; б — все клетки экспрессируют В-клеточный антиген CD19 (попадают в регион Ml). В этом случае положительная реакция на другие антигены будет относиться к лейкозным В-лимфоцитам, что позволяет охарактеризовать иммунофенотип В-ХЛЛ. Здесь и на рис. 24.2; 24.15; 24.18; 24.19 и 24.22 автоматически выдаваемая проточным цитометром подпись FSC-Height (1) vs SSC—Height (2) означает: на оси абсцисс — уровень (Height — высота) сигнала прямого рассеяния света лазерного луча-параметра, отражающего размер клетки (FSC — Forward Scatter), на оси ординат — уровень бокового рассеяния света лазерного луча — параметра, отражающего гранулярность клетки (Side Scatter). Цифра в скобках, например (1), означает номер анализируемого параметра: 1 — FSC, 2 — SSC, 3 —FL1 (флюоресценция 1, обычно флюоресцеина изотиоцианат, FITC), 4 — FL2 (флюоресценция 2, обычно фикоэритрин, РЕ), 5 — FL3 (флюоресценция 3, обычно конъюгат РЕ/Су5).

При диагностике гемобластозов необходимо участие специалистов различного профиля: гистологов, цитологов, гемоцитологов, иммунологов, цитогенетиков, молекулярных биологов. Важным при изучении гемобластозов является формирование панели диагностических моноклональных антител (МКА). Набор используемых антител может различаться в зависимости от целей исследования. Определены некоторые стандарты для проведения иммунодиагностики лейкозов и лимфом методами проточной цитофлюориметрии.

Не существует единых стандартизованных подходов к исследованию биопсийного материала. В зависимости от пристрастий и опыта патолога, а также по ряду организационных причин (оборудование, реактивы) иммунодиагностика лимфом, основанная на изучении биопсийного материала, может проводиться по парафиновым блокам, криостатным срезам или путем дезинтеграции клеток и переведения их в суспензию. При исследовании по парафиновым блокам, (наиболее распространенный метод), обычно используют традиционное иммуногистохимическое (иммуноферментное) окрашивание материала. При анализе по криостатным срезам чаще применяется иммунофлюоресцентный метод.
При переведении клеток в суспензию становится возможным использование проточной цитофлюориметрии. Каждый из этих методов имеет свои плюсы и минусы.

Опыт РАМН, основанный на иммунологическом изучении нескольких тысяч лимфом, свидетельствует о необходимости использования различных методов для иммунодиагностики лимфом. Иммунофенотипическое исследование при диагностике лимфом целесообразно проводить по гистологическим срезам опухоли. Это позволяет изучать лимфомные клетки в их естественных взаимоотношениях с неопухолевыми клетками лимфатического узла, устанавливать характер роста опухоли (нодулярный, диффузный). Исследование лимфомных клеток на срезах под микроскопом позволяет раздельно оценить крупноклеточный и мелкоклеточный компоненты, что не всегда возможно при использовании проточной цитометрии. Методом первой линии при проведении иммунодиагностики лимфом по биопсийному материалу целесообразно считать иммунофлюоресцентный.

Иммунодиагностика гемобластозов
Цитограмма иммунофлюоресцентного окрашивания лимфоцитов крови при лимфоме из клеток мантии.
Прямая реакция иммунофлюоресценции: на оси абсцисс — МКА CD5 (метка — флюоресцеин, FITC), на оси ординат — МКА CD20 (метка — фикоэритрин, РЕ). Присутствуют нормальные Т-лимфоциты (яркая экспрессия CD5, отсутствие CD20); значительная часть клеток более слабо экспрессирует CD5 и имеет на мембране CD20 (лейкемическая популяция); присутствует небольшая пропорция нормальных В-клеток — CD20+ CD5-.

Иммуноферментное окрашивание применяется при лимфомах с плеоморфным клеточным составом, где необходима детальная морфологическая характеристика опухолевой ткани. Во всех случаях, когда не доступен свежий биопсийный материал опухоли, производят иммуноферментное окрашивание по блокам (особенно при анализе консультативного материала из других учреждений).

При иммуноморфологическом анализе биопсийного материала опухоли предпочтение отдается лю-минисцентной микроскопии. Случаи, при которых установить иммунологический вариант опухоли иммунофлюоресцентным методом не представляется возможным, являются редкими. Существуют варианты лимфом, которые из-за своей редкости или полиморфизма клеточного состава нуждаются в детальной морфологической характеристике. Иммунофлюоресцентный анализ удобен в тех случаях, когда необходимо каждодневное исследование множества биопсийных образцов (в условиях крупных научных медицинских центров). Этот метод при использовании качественных реактивов и хорошего люминисцентного микроскопа является практически свободным от артефактов, достаточно быстрым в исполнении и информативным.

Другой важный аргумент в пользу иммунофлюоресцентного метода — необходимость использования широкого набора моноклональных антител в каждом случае при проведении иммунологической диагностики лимфом. В отличие от солидных опухолей при диагностике лимфом требуется не только установить гистогенетическую принадлежность опухоли, но также определить ее подвариант и степень зрелости (по крайней мере, разграничить лимфомы из клеток-предшественниц и лимфомы из периферических клеток). Обычно для этого требуется 12—15 маркеров. Иммунофлюоресцентный метод при проведении исследований на криостатных срезах является с организационной точки зрения трудоемким: необходимо наличие криомикротома, квалифицированной работы с криостатными срезами, люминисцентный микроскоп, а в идеале и программное компьютерное обеспечение для хранения наиболее информативных препаратов в виде компьютерных файлов.

Если эти организационные вопросы удается решить, рутинная иммунофлюоресцентная диагностика лимфом становится высокоинформативным, быстрым и свободным от артефактов методом.

Набор моноклональных антител для иммунодиагностики гемобластозов

Маркер Клеточный тип Антиген
CD1a Кортикальные тимоциты, субпопуляция В-клеток, дендритические клетки HLA-подобный белок, может связываться с b2-микроглобулином
CD2 Т-клетки, большинство NK-клеток Рецептор Е-розеткообразования, лиганд LFA-3
CD3 Мембранная экспрессия на зрелых Т-клетках, цитоплазматическая экспрессия на незрелых Т-клетках Ассоциирован с Т-клеточным рецептором, опосредует передачу сигнала
CD4 Хелперные/«индукторные» Т-лимфоциты, моноциты, незрелые миелоидные клетки Рецептор для молекул HLA II и ВИЧ
CD5 Тимоциты, зрелые Т-клетки, субпопуляция В-клеток Сцеплен с Т-клеточной пролиферацией
CD7 Т-клетки, NK-клетки, субпопуляция незрелых миелоидных клеток Белок с мол. массой 40 000 Д, костимуляторная молекула в активации Т-клеток
CD8 Цитотоксические/супрессорные Т-клетки, субпопуляция NK-клеток Рецептор для молекул HLAI
CD10 с-ОЛЛ, лимфоидные клетки-предшественницы, нейтрофилы, подкласс зрелых В-клеток Общий антиген ОЛЛ (CALLA), нейтральная эндопептидаза (энкефалиназа)
CD11b Моноциты, макрофаги, нейтрофилы, NK-клетки Молекула адгезии, C3bi-рецептор
CD11c Моноциты, нейтрофилы, NK-клетки, субпопуляция В-клеток Молекула адгезии, gp150/95
CD13 Миелоидные клетки Аминопептидаза N
CD14 Моноциты, слабая экспрессия на нейтрофи-лах Рецептор для LPS
CD15 Нейтрофилы, слабая экспрессия на моноцитах Х-гаптен, 3-фукозил-N -ацетил-лактозамин
CD16 NK-клетки, нейтрофилы, субпопуляция моноцитов Низкоаффинный рецептор для IgG
CD19 Предшественники В-клеток и зрелые В-клетки Мост для сигнала через мембранные иммуноглобулины
CD20 Субпопуляция В-клеточных предшественников, В-клетки Ионный канал, субстрат протеинкиназы С
CD22 Мембранная экспрессия на В-клетках, цитоплазматическая экспрессия на В-клеточных предшественниках Родствен NCAM, мост для сигнала через мембранные иммуноглобулины
CD23* Субпопуляция В-клеток Низкоаффинный Fc-рецептор для IgE
CD24 В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты, нейтрофилы Сцепленный с GPI (гликозил-фосфатидилинозитолом) гликопротеин с мол. массой 35—45 000 Д
CD25 Активированные Т- и В-лимфоциты а-Цепь рецептора для ИЛ-2
CD30 Активированные Т- и В-лимфоциты, клетки Березовского—Штернберга Гликопротеин с мол. массой 105 000 Д; антиген Ki-1
CD33 Моноциты, миелоидные предшественники, слабая экспрессия на нейтрофилах Гликопротеин с мол. массой 67 000 Д, обладает лектиновой активностью
CD34 Миелоидные и лимфоидные клетки-предшественницы Гликопротеин с мол. массой 105-120 000 Д, молекула адгезии
CD38 Активированные лимфоциты, субпопуляция В-клеток, плазматические клетки Гликопротеин с мол. массой 45 000 Д, АДФ-рибозилциклаза
CD41a Тромбоциты, мегакариоциты Гликопротеин IIb/IIIa, рецептор фибронектина
CD42b Тромбоциты, мегакариоциты Гликопротеин Ib, часть рецептора для фактора Виллебранда
CD45 Все лейкоциты Антиген Т200, тирозинфосфатаза
CD61 Тромбоциты, мегакариоциты Гликопротеин IIIа, b-цепь витронектинового рецептора
CD64 Моноциты, макрофаги Высокоаффинный рецептор для IgG
CD65 Нейтрофилы, слабая экспрессия на моноцитах Церамид додекасахарид 40, MKAKCD65 ингибируют респираторный взрыв в нейтрофилах
CD71 Эритроидные клетки, активированные Т- и В-лимфоциты, макрофаги Рецептор трансферрина
CD79a В-лимфоциты, включая незрелые В-клетки Iga/mb-1, часть В-клеточного рецептора для антигена
CD103 Интраэпителиальные лимфоциты HML-1
CD117 Миелоидные клетки-предшественницы c-Kit, рецептор для фактора стволовых клеток
CD163 Моноциты, макрофаги Семейство рецепторов-мусорщиков
FMC7 Дифференцированные В-лимфоциты Гликопротеин с мол. массой 105 000 Д
Гликофорин А Эритроциты, эритробласты и эритроидные клетки-предшественницы Сиалированный гликопротеин
HLA-DR В-лимфоциты, активированные Т-лимфоциты, моноциты, клетки-предшественницы Часть HLA II комплекса
МРО Лизосомальная экспрессия в нейтрофилах и моноцитах, включая незрелые миелоидные клетки Миелопероксидаза
TdT Ядерная экспрессия в лимфоидных клетках-предшественницах Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза
TCR а/b Большинство Т-лимфоцитов a/b-цепи Т-клеточного рецептора
TCR у/q Подкласс Т-лимфоцитов у/5-Цепи Т-клеточного рецептора
к Мембранная экспрессия на В-лимфоцитах L-цепь иммуноглобулина к-типа
h Мембранная экспрессия на В-лимфоцитах L-цепь иммуноглобулина h-типа
u В-лимфоциты Н-цепь иммуноглобулина класса u

Диагностика лимфом по криостатным срезам, окрашенным конъюгатами моноклональных антител с флюорохромами, требует большого опыта и навыка работы. Основное отличие от стандартной гистологической и гистохимической диагностики состоит в том, что в каждом срезе при иммунофлюоресцентном окрашивании видны только антигенпозитивные клетки в темном поле. По этой причине необходимо знание того, как распределены те или иные антигенпозитивные клетки в нормальном лимфатическом узле для установления тканевой атипии при лимфомах.

Главным преимуществом флюоресцентного метода, проводимого на криосрезах опухолевой ткани, фиксированных в ацетоне, является то, что исследование антигенов осуществляется без их разрушения или видоизменения. Это отличает его от стандартно используемых для иммуноферментного метода фиксации в формалине и парафиновой заливки, в процессе которой многие белковые молекулы разрушаются или видоизменяются. В результате их антигенные свойства утрачиваются, что требует дополнительной обработки (восстановления) перед проведением иммуноферментного анализа.

Панели МКА для диагностики лимфом на срезах опухоли не являются стандартизованными. Это обусловлено тем, что патологи разных стран отдают предпочтение работе на криостатных либо парафиновых срезах.

Алгоритм исследования лимфом в отечественных институтах гематологии таков. Криостатные срезы окрашивают в непрямой реакции иммунофлюоресценции на следующие маркеры: HLA-DR, CD23, CD38, CD19, CD37, CD5, CD45, CD163, CD21, CD15, CD7, CD4, CD8, CD10, CD3. Использование этой панели является достаточным для подтверждения гемопоэтической природы опухоли и установления большинства вариантов неходжкинских лимфом: лимфомы из малых лимфоцитов/ В-ХЛЛ, лимфомы из клеток мантии фолликулов (для верификации диагноза определяется ядерная экспрессия циклина D1), фолликулярной лимфомы (для дифференциальной диагностики с реактивными процессами целесообразно определение bcl-2), лимфом из клеток маргинальной зоны, вариантов крупноклеточных лимфом, Т-клеточных лимфом.

При крупноклеточных лимфомах, Т-клеточных лимфомах, лимфогранулематозе, негемопоэтических опухолях диагностическая панель антител расширяется: включают по показаниям маркеры CD1a, CD2, TCRab и TCRy5, CD30, CD15, цитокератины, Egp34. При лимфомах из клеток-предшественниц и миелобластных гематосаркомах необходимо использовать CD34, CD 13, CD33 и некоторые другие маркеры.

Цели и задачи иммунологического изучения опухолей из миелоидных клеток (ОМЛ) и лимфоидных клеток (ОЛЛ/лимфомы из клеток-предшественниц и периферические лимфомы) различны.

- Читать далее "Иммунодиагностика острых миелоидных лейкозов"


Оглавление темы "Иммунодиагностика в гематологии":
  1. Медиастинальная В-крупноклеточная лимфома - диагностика
  2. Анапластическая крупноклеточная лимфома и лимфома Ходжкина - дифференциальная диагностика
  3. Задачи и принципы иммунодиагностики гемобластозов
  4. Алгоритм иммунодиагностики гемобластозов
  5. Иммунодиагностика острых миелоидных лейкозов
  6. Антигены CD13, CD65, CD34 при остром миелоидном лейкозе
  7. Антигены CD15, CD11b, CD14 при остром миелоидном лейкозе
  8. Маркеры гликофорин А, CD61 при остром миелоидном лейкозе
  9. Прогностическое значение иммунологических маркеров острых миелоидных лейкозов
  10. Иммунодиагностика лимфомы из малых лимфоцитов - хронического лимфоцитарного лейкоза
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта