Олигонуклеотидные микрочипы созданы путем прикрепления к поверхности платформы синтетических нуклеотидных зондов (12-80-мономерных олигонуклеотидов), представляющих собой уникальные участки генов. С помощью экспериментального образца mPНK синтезируется кДНK, затем в условиях in vitro проводят этап транскрипции для получения биотип-меченой кРНК, которая, в свою очередь, соединяется с соответствующим микрочипом.
Этот микрочип обрабатывают флуоресцентным красителем с прикрепленным к нему авидином (белком, прочно связывающимся с биотином) и активируют с помощью лазера. На одном олигонуклеотидном микрочипе проводят анализ только одного образца, что позволяет получить абсолютный уровень каждой молекулы РНК. Измеряемая интенсивность сигнала отражает уровень экспрессии каждого гена.
Метод SAGE
Метод SAGE используют для характеристики экспрессии генов, основанной на прямом определении последовательности (секвеиировапии) трапскриптов. Основное его преимущество состоит в определении и анализе трапскриптов с неизвестной последовательностью. Для этого анализа необходимо в 10 раз большее количество мРНК, поэтому он более трудоемкий, чем анализ некоторых микрочипов, даже если секвенирование автоматизировано, поскольку для самого простого сравнения двух образцов требуется определить последовательность примерно 1,5 х 106 п.н.
Этот факт становится единственным препятствием, если количество РНК слишком мало, тогда как основным преимуществом метода служит его более высокая чувствительность к изменению уровня экспрессии.
После получения результатов путем обработки изображения данные преобразуют в три этапа: нормализация, фильтрация и компьютеризация (математическая обработка). Нормализация учитывает технические факторы, включая производство микрочипов, различия на этапе включения красителя и неравномерность распределения образца во время гибридизации, и проводится для обеспечения адекватного сравнения данных, получаемых на отдельных микрочипах.
Фильтрация результатов подразумевает отбор тех результатов, которые с наибольшей вероятностью окажутся достоверными. Типичные критерии фильтрации включают оценку качества сигнала и критерий кратной разницы в уровне экспрессии гена. Часто при анализе на микрочипах дифференциальная экспрессия геном в 1,5-2 раза отличается от относительного уровня их экспрессии.
Важнейшим при анализе данных является определение сходства и различий. Используют два принципиальных подхода: с учетом клинических данных (контролирующий) и независимый кластерный анализ (бесконтрольный). Методы с учетом клинических данных применяют для обнаружения генов, уровень экспрессии которых достоверно различается между группами образцов, и обнаружения генов, которые точно характеризуют образец.
Существует два наиболее часто используемых метода с учетом клинических данных — метод «ближайших соседей» и метод «опорных векторов». При независимом кластерном анализе исследователи вместо определения наилучшего способа предсказания ответа пытаются лишь отыскать в результатах внутренние взаимосвязи. К четырем наиболее часто применяемым методам независимого кластерного анализа относятся: иерархическая кластеризация, самоорганизующиеся карты, сходящиеся сети и метод главных компонент.
Эти аналитические методы подробно описаны. После компьютеризации полученных данных проводят их статистический анализ. Перед оценкой реальной значимости любых полученных на микрочипах результатов их необходимо подтвердить с помощью независимого тестирования по уровню экспрессии РНК методом количественной ПЦР с обратной рестрикцией или традиционным методом Northern блот.
