MedUniver Кардиология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Кардиология:
Кардиология
Основы кардиологии
Аритмии сердца
Артериальная гипертензия - гипертония
ВСД. Нейроциркуляторная дистония
Детская кардиология
Сердечная недостаточность
Инфаркт миокарда
Ишемическая болезнь сердца
Инфекционные болезни сердца
Кардиомиопатии
Болезни перикарда
Фонокардиография - ФКГ
Электрокардиография - ЭКГ
ЭхоКС - УЗИ сердца
Бесплатно книги по кардиологии
Пороки сердца:
Врожденные пороки сердца
Приобретенные пороки сердца
Кардиомиопатии
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Блоттинг и ее техника

Блоттинг — это способ, позволяющий идентифицировать ДНК, РНК или белок но размеру молекулы. Для анализа ДНК применяют Southern блот; РНК идентифицируют с помощью Northern блота; белки разделяют посредством Western блота. Принципы блоттинга довольно просты. Смесь молекул подвергают электрофорезу в геле, с помощью которого анализируемые компоненты разделяются согласно своему размеру и/или электрическому заряду. Обычно используют агарозный гель, на одном конце которого расположены лунки, куда и вносят исследуемую смесь.

Гель помещают в буфер и пропускают электрический ток. Молекулы движутся по электрическому полю. Поскольку ДНК и РНК являются кислотами и несут отрицательный заряд, они мигрируют к положительному электроду. Агарозный матрикс препятствует миграции крупных молекул, поэтому разделение происходит по размеру молекул. По завершении электрофореза гель удаляют из буфера и на него сверху помещают нейлоновый фильтр (мембрану) и сухой абсорбирующий материал.

Буфер из геля впитывается в абсорбирующий материал, перенося за собой разделившиеся молекулы, которые остаются на нейлоновой мембране. Эту мембрану обрабатывают, чтобы зафиксировать молекулы на ее поверхности; при этом получается зеркальное отражение исходного геля. Затем мембрану промывают в растворе со специальны ми молекулами (зондами), которые распознают (гибридизируются) С искомой молекулой, и отмывают для удаления несвязавшегося зонда. При Southern блоттинге и Northern блоттинге в качестве зонда используют небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, комплементарную исследуемой молекуле.
Нуклеиновую кислоту помечают радиоактивной меткой, определяемой при экспозиции на рентгеновскую пленку или с помощью других методов.

По положению гибридизированного зонда, который проявляется в виде полосы, можно оценить размер фрагмента ДНК или РНК. При одновременном нанесении на соседние дорожки молекулярных маркеров известного размера можно определить точный размер исследуемого фрагмента ДНК или РНК. Для идентификации белка (Western блот) зонд представляет собой антитело, которое распознает искомый белок. При нанесении на гель метчиков с известными размерами можно установить размеры исследуемого белка.

Блоттинг используют и для других целей, включая картирование сайтов рестрикции определенного гена после его обработки рестрикциоппыми ферментами, а также для патогенетического анализа с целью сравнения сайтов геномной ДНК исследуемого и референсного образца.

Саузерн блоттинг ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — процесс амплификации, который осуществляют в пробирке. Фрагмент ДНК или РНК, подлежащий амплификации, помещают в пробирку и добавляют два коротких олигонуклеотидных праймера (химически синтезированные одноцепочечные фрагменты ДНК). Праймеры инициируют процесс амплификации, продолжающийся в виде серии циклов, в которых исходная ДНК, называемая матрицей, разделяется на отдельные цепи. При разделении молекулы ДНК на две цепи происходит связывание, или отжиг, праймеров с соответствующими фрагментами, несущими комплементарные последовательности на другом конце одноцепочечной ДНК.

Устойчивый к действию высоких температур фермент ДНК-иолимераза присоединяет нуклеотидные основания к концам каждого праймера, прочитывая последовательность одноцепочечной ДНК и образуя комплементарную ей копию.

Когда полимераза достигает конца одной цепи, формируется новая двухцепочечная ДНК, и начинается новый цикл, включающий нагревание и разделение двойной спирали (денатурация молекулы ДНК) с последующим отжигом праймеров и наращиванием повой цепи ДНК-полимеразой. Каждый цикл амплификации в ходе полимеразной цепной реакции удваивает количество ДНК-матриц. С помощью ПЦР можно получить миллионы копий того или иного фрагмента ДНК всего за несколько часов, даже если исходно была только одна молекула ДНК.

Полная амплификация выполняется в плотно закрытых пробирках или лунках специальных плашек на приборе, в котором имеется автоматизированная программа нагревания и охлаждения образна. В настоящее время ПЦР стала обычным инструментом получения достаточного количества идентичного генетического материала для исследований и анализов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

- Читать далее "Генотип и геномика. Протеомика и фенотип"


Оглавление темы "ДНК и методы молекулярной биологии":
1. Пролиферация гладкомышечных клеток (ГМК). Функции клеточного цикла
2. ДНК и ее структура. Хромосомы
3. Гены и геном. РНК и синтез белков
4. Методы молекулярной биологии. Клонирование ДНК
5. Блоттинг и ее техника. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
6. Генотип и геномика. Протеомика и фенотип
7. Генетические вариации и мутации. Наследственные формы артериальной гипертензии
8. Полиморфизм и гаплотип. Анализ сцепления генов и анализ ассоциаций
9. Сканирование полноразмерного генома. Микрочипы для комплементарной ДНК (кДНК)
10. Олигонуклеотидные микрочипы. Метод SAGE
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта