MedUniver Физиология человека
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Физиология человека:
Физиология
Физиология клетки
Эндокринная система
Пищеварительная система
Физиология клеток крови
Обмен веществ. Питание
Выделение.Функции почек
Репродуктивная функция
Сенсорные системы
Физиология иммунной системы
Система кровообращения
Дыхательная система
Видео по физиологии
Книги по физиологии
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Использование лейцина, фенилаланина для оценки метаболизма белков

Внутривенная инфузия в течение 4-6 час обогащенного L-[1-13С] лейцина (> 95% 13С) стала методом выбора оценки кинетики белка в организме человека. Поскольку лейцин является незаменимой аминокислотой, источником немеченого свободного лейцина, присутствующего в плазме, может быть только экзогенный лейцин, попадающий в организм с пищей или внутривенно (I), или свободный лейцин, образующийся в результате распада белка (В) в организме.
Таким образом, Ra = I + В. С другой стороны, лейцин может только подвергнуться окислению (до СО2 и мочевины) или включиться в синтез белка (S, или неокислительное высвобождение лейцина, NOLD).

В ходе инфузии [13С]лейцина молекулы меченого лейцина пополняют пул свободного лейцина, повторяя путь молекул немеченого лейцина. Благодаря окислению [13С]лейцина в выдыхаемом воздухе появляется 13СО2, а синтез белка приводит к включению [13С]лейцина в белки организма.

Растворение [13С]лейцина в природном пуле лейцина называется его обогащением, поскольку [13С]лейцин уже существует в небольших количествах и инфузия следового количества просто приводит к увеличению пула лейцина сверх исходного содержания в организме. В стабильном состоянии 13С-обогащение пула свободного лейцина отражает отношение скорости инфузии [13С]лейцина (i) к Ra лейцина.

Таким образом, Ra (мкмоль/кг/мин) можно вычислить исходя из разведения [13С]лейцина. Ra = i [(Ei/Ep) - 1], где Ei и Ер (эксцесс, моль%) — 13С-обогащения в вводимом растворе и плазме (соответственно) в стабильном состоянии, а i — скорость следовой инфузии (мкмоль/кг/мин). Поскольку Ra = I + В, то В = Ra - I. При принятом условии постоянства концентрации лейцина в течение всего времени проведения эксперимента Ra = Rd. Путем сбора выдыхаемого воздуха можно определить окисление лейцина (Ох).

Показатель вовлечения лейцина в синтез белка может быть вычислен по формуле: NOLD = Ra - Ох. Все данные впоследствии можно экстраполировать на определение абсолютной скорости синтеза, окисления и расщепления общего белка организма (г белка/кг/сут), поскольку известно, что 1 г белка организма содержит 610 мкмоль лейцина. Для инфузии [13С]лейцина необходима установка двух внутривенных катетеров: один (короткий) катетер обычно вводят в переднюю локтевую вену для введения меченого [13С]лейцина, другой — в контрлатеральную поверхностную вену для взятия анализов крови.

Во время инфузии изотопа рука располагается на подогреваемой подушке для создания эффекта «артериализированной венозной» крови, призванного более точно отражать изменения в смешанной артериальной крови.

Лейцин в оценке метаболизма белка
Использование [13С]лейцина для оценки метаболизма белка в организме человека.
NOLD — неокислительное высвобождение лейцина;
ППП — полное парентеральное питание.

Некоторые допущения модели [13С]лейцина:
- Отсутствие изотопного эффекта
- Отсутствие метаболического эффекта вводимого меченого атома
- Фракция производимого 13СО2, которая восстанавливается при дыхании, известна
- Отсутствие «рециркулирующих» меченых атомов
- Исход для меченого атома (даже в случае, когда помечен один углерод) равнозначен исходу для всей молекулы
- Пул лейцина в плазме отражает внутриклеточный пул

Модель лейцина основана на нескольких допущениях, большинство из которых выдержали два десятилетия интенсивных проверок и подтвердили свою правильность. Например, не вызывает сомнений, что синтез белка происходит не в плазме, а во внутриклеточном пространстве.

Истинным предшественником лейцина в синтезе белка является тРНК-связанный лейцин, и оценка накопления изотопа во внутриклеточном пространстве предполагает этические и технические затруднения, поскольку связана со взятием биопсийного материала и проведением трудоемкого процесса экстракции интактного тРНК-связанного лейцина. Вместо этого накопление изотопа оценивают по пулуа-кетоизокапроата (KIC), кетокислоты лейцина, который можно назвать суррогатным пулом для тРНК-связанного лейцина.

В ходе инфузии [13С]лейцина он мгновенно трансаминируется в кетокислоту (13С-KIC), попадая во внутриклеточное пространство, причем известно, что этот KIC находится в свободном равновесии с KIC плазмы. Поскольку KIC получается только из лейцина и продуцируется только внутри клеток, 13С-KIC может выступать в роли подходящего суррогатного пула для внутриклеточного лейцина. Количество 13C-KIC можно легко определить. Было обнаружено, что накопление в плазме 13С-КIС происходит примерно на 10-20% медленнее по сравнению с накоплением лейцина. Исследования биопсии тканей, проведенные с участием людей и применением множественных меченых атомов KIC и лейцина, а также опыты на животных доказали, что KIC является достоверным отражением использования пула предшественников лейцина для синтеза белка. Накопление (обогащение) изотопа оценивают с помощью технологии масс-спектрометрии.

IRMS используют для определения очень малого накопления (эксцесс < 0,01 моль%) в относительно чистых газах (например, накопление 13С в выдыхаемом СО2), в то время как газовую хромато-масс-спектрометрию применяют для определения более значимых накоплений (эксцесс > 0,1 моль%) в органических молекулах в сложных структурах (например, в лейцине плазмы или KIC). Наконец, газовая хромато-комбустион-изотопная масс-спектрометрия объединяет способность газовой хроматографии различать множественные «пики» в плазме с возможностью IRMS определять очень малые накопления. При таком подходе газовую хроматографию используют для сепарации органических молекул в сложных структурах (например, лейцина в плазме), когда интересующая молекула превращается "online" в чистый газ (например, в СО2 при 800 С в печи для сгорания) и в дальнейшем уже подвергается анализу с помощью IRMS как газ.

Чтобы оценить окисление лейцина нужно провести непрямую калориметрию для учета всей продукции СО2 и забор проб воздуха как из вентиляционного колпака, так и из контура выдоха, если пациент находится на ИВЛ, для оценки 13СО2-обогащения. Поскольку восстановление производимого в результате метаболических процессов 13СО2 не равно по времени короткой инфузии изотопа, для коррекции неполного восстановления нужен корригирующий фактор. Даже в описанных в литературе случаях, когда восстановление оценивали в 80%, в идеале его нужно было определять отдельно для каждой изучаемой популяции или клинического случая, т.к. его значение может варьировать. Один из способов оценки — проведение короткой (в течение 2 час) инфузии меченого бикарбоната натрия непосредственно перед введением меченого лейцина.

Дополнительное преимущество данного подхода заключается в обеспечении оценки СО2 без проведения непрямой калориметрии.

Сбор воздуха при дыхании представляет собой сложный процесс, поэтому был предложен новый дизайн исследований. Так, поскольку окисление лейцина в конечном итоге ведет к невосполнимой потере аминокислот, некоторые исследователи оценивали окисление [13С] лейцина путем определения экскреции азота мочи во время инфузии [13С]лейцина без взятия проб воздуха.

В качестве альтернативы вместо меченого лейцина может быть введен меченый фенилаланин. Поскольку он является незаменимой аминокислотой, его метаболизм похож на метаболизм лейцина. Единственное отличие — при введении L-[ring-2Н4]фенилаланина немедленным продуктом его окисления является L-[ring-2H4]тирозин, который можно определить в плазме. Отношение [2Н4]тирозина к [2Н5]фенилаланину отражает ту часть продукции тирозина, которая обусловлена окислением фенилаланина. Основное ограничение данного подхода заключается в необходимости комбинировать его с введением отдельного меченого атома, например 13С, в молекуле тирозина для определения Ra всего тирозина.

Несмотря на то что современные методы (например, газовая хромато-масс-спектрометрия) позволяют определять накопление изотопа менее чем в 100 мкл плазмы, забор крови затруднен из этических соображений (если установка катетера обусловлена только необходимостью проведения инфузии изотопа, а не интересами клинического мониторинга). Это стало основанием для поиска альтернативных методов. Схожие параметры были получены при обогащении [13С]лейцином плазмы и мочи. Позднее Darling и соавт. продемонстрировали небольшое различие в обогащении плазмы и мочи, характерное для нескольких аминокислот. Объяснить это можно значительным присутствием D-[13С]аминокислот, являющихся загрязняющими примесями выпускаемых промышленностью меченых атомов.

Появление этих примесей в моче — результат преимущественной экскреции D-аминокислот почечными канальцами, поэтому следует убедиться в оптической чистоте (100%) меченой аминокислоты перед началом сбора мочи.

Для выяснения регуляции кинетики белка у новорожденных при различных условиях была исследована кинетика лейцина. Выявлено, что инсулин у детей с ОНМТ, так же как у взрослых, подавляет протеолиз и снижает синтез белка. Как показали исследования недоношенных детей с респираторным дистресс-синдромом, раннее (начиная с первого дня жизни) внутривенное введение аминокислот по сравнению с традиционной инфузией только глюкозы приводит к улучшению баланса белка посредством стимуляции его синтеза. Ответ организма на постепенное увеличение дозы аминокислот был изучен у клинически стабильных недоношенных детей в первую неделю жизни: в отличие от протеолиза, наблюдаемого у здоровых доношенных новорожденных, зависимого от дозы подавления, эндогенная скорость накопления лейцина не зависела от введения аминокислот.

Поскольку глютамин в растворах относительно нестабилен, традиционно используемые для парентерального питания растворы аминокислот не содержат глютамина. Кроме того, глютамин может быть «условно незаменим» в ситуациях, связанных со значительным стрессом, например в случае детей с ОНМТ, получающих парентеральное питание. Было выявлено, что введение обогащенных глютамином препаратов для парентерального питания снижает окисление лейцина и распад белка у недоношенных детей, находящихся на парентеральном питании.

- Читать далее "Методы оценки кинетики белков, аминокислот в организме"


Оглавление темы "Методы оценки метаболизма":
  1. Методика непрямой калориметрии для оценки скорости расхода энергии и окисления веществ
  2. Метод оценки кровотока в тканях для оценки питания новорожденных детей
  3. Методы определения состава тела - содержания воды, жира
  4. Методы разведения изотопа для анализа метаболизма in vivo
  5. Методы стабильного изотопа для оценки поступления питательных веществ и расхода энергии
  6. Методы оценки метаболизма углеводов и жиров в организме
  7. Оценка баланса азота для анализа метаболизма белков
  8. Использование глицина для оценки метаболизма белков
  9. Использование лейцина, фенилаланина для оценки метаболизма белков
  10. Методы оценки кинетики белков, аминокислот в организме
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта