MedUniver Физиология человека
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Физиология человека:
Физиология
Физиология клетки
Эндокринная система
Пищеварительная система
Физиология клеток крови
Обмен веществ. Питание
Выделение.Функции почек
Репродуктивная функция
Сенсорные системы
Физиология иммунной системы
Система кровообращения
Дыхательная система
Видео по физиологии
Книги по физиологии
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Флюоресцентная гибридизация in situ. Применение технологии FISH

Традиционная цитогенетика при изучении кариотипа всегда была ограничена бэндовым уровнем разрешения. Даже при использовании высокоразрешающих методов дифференциального окрашивания хромосом мы всего лишь выявляли большее количество бэндов на хромосоме, но не были уверены, что добираемся до молекулярного уровня разрешения. Последние достижения ДНК-технологий и цитогенетики сделали возможным использование методов FISH для анализа изменений хромосомной ДНК на молекулярном уровне. Молекулярная цитогенетика обеспечила революционный прорыв в цитогенетике, позволив:

• осуществлять анализ структуры ДНК хромосом в диапазоне 10-100 килобаз;
• проводить диагностику неделящихся интерфазных клеток, что оказало огромное влияние на пренатальную диагностику и преимплантационную генетическую диагностику (ПГД).

Технология FISH использует ДНК-зонд, который связывается или ренатурирует специфические последовательности ДНК внутри хромосомы. Денатурированный зонд инкубируется с нативной ДНК клетки, также денатурированной до одноцепочечного состояния. Зонд замещает биотин-дезоксиуридинтрифосфат или дигоксигенин-уридинтрифосфат на тимидин. После ренатурации зондом нативной ДНК комплекс «зонд-ДНК» можно обнаружить при добавлении меченного флюорохромом авидина, связывающегося с биотином, или меченного флюорохромом антидигоксигенина. Дополнительное усиление сигнала можно получить, добавив антиавидин и изучив получившийся комплекс с помощью флюоресцентной микроскопии. Пометив несколькими различными флюорохромами разные ДНК-зонды, можно одновременно визуализировать несколько хромосом или хромосомных сегментов внутри одной клетки в виде разноцветных сигналов.

флюоресцентная гибридизация - FISH

Возможность определения специфических генных сегментов, имеющихся или отсутствующих на хромосомах, позволила диагностировать синдромы генных последовательностей на уровне ДНК, как, впрочем, и транслокации в интерфазных ядрах, зачастую — в отдельных клетках.

Материалом для FISH могут служить или метафазные хромосомы, полученные из делящихся клеток, или интерфазные ядра из клеток, не находящихся в стадии деления. Срезы предварительно обрабатывают РНКазой и протеиназой для удаления РНК, которая может вступать в перекрестную гибридизацию с зондом и хроматином. Затем их нагревают в формамиде, чтобы денатурировать ДНК, и фиксируют ледяным спиртом. Затем зонд подготавливают к гибридизации путем нагревания. После этого зонд и хромосомный препарат смешивают и герметизируют покровным стеклом при 37 °С для гибридизации. Изменяя температуру инкубации или солевой состав раствора для гибридизации, можно повысить специфичность связывания и уменьшить фоновую маркировку.

Применение флюоресцентной гибридизации in situ - технологии FISH

Эффективность технологии FISH впервые была продемонстрирована при локализации генов на хромосомах. С внедрением метода флюоресцентного мечения, гибридизация in situ оказалась незаменимой для диагностики хромосомных аномалий, не выявляемых традиционными методами бэндинга. FISH также сыграла ключевую роль в совершении одного из самых необычных открытий современной генетики — геномного импринтинга.

флюоресцентная гибридизация - FISH

Свое развитие технология FISH получила в трех формах. Центромерные, или альфа-сателлитные, зонды характеризуются относительной хромосомной специфичностью, их использовали чаще всего в генетике интерфазных клеток. Эти зонды генерируют в некоторой степени диффузные сигналы адекватной силы в области центромеры, но не вступают в перекрестную гибридизацию с хромосомами, имеющими аналогичные центромерные последовательности. В настоящее время разработаны однокопийные зонды, дающие дискретный сигнал от специфического бэнда хромосомы и позволяющие избежать феномена перекрестной гибридизации. Эти зонды также можно использовать для определения копийности и специфичных регионов хромосомы, предположительно связанных с тем или иным синдромом. Однокопийные и центромерные зонды, разработанные для хромосом 13, 18, 21, X и Y, используют для пренатальной диагностики.

Возможно также «окрашивание» целых хромосом с помощью FISH. Благодаря технологии спектрального кариотипирования, при которой используют смесь различных флюорохромов, теперь стало возможным создание уникального флюоресцентного паттерна для каждой отдельной хромосомы с 24 отдельными цветами. Эта технология позволяет определять сложные хромосомные перестройки, не видимые при использовании традиционных цитогенетических методик.

Метод FISH в пренатальной диагностике. Для женщин старшего репродуктивного возраста беременность может оказаться поводом не столько для радости, сколько для беспокойства. С возрастом женщины связан риск развития хромосомных аномалий плода. Амниоцентез, осуществляемый на 16-й неделе беременности, с последующим анализом кариотипа занимает 10-14 дней. Использование FISH в предварительном обследовании позволяет ускорить диагностику и уменьшить время ожидания. Большинство генетиков и лабораторий придерживаются мнения, что метод FISH не следует использовать изолированно для принятия решения о дальнейшем ведении беременности. Метод FISH обязательно следует дополнять кариотипическим анализом, и его результаты как минимум должны коррелировать с патологической картиной ультразвукового исследования (УЗИ) или биохимического скрининга по крови матери.

Синдромы генных последовательностей известны также под названием синдромов микроделеции, или сегментарной анеусомии. Это делеции смежных фрагментов хромосомы, вовлекающие, как правило, многие гены. Синдромы генных последовательностей были впервые описаны в 1986 г. с использованием классических методик цитогенетики. Теперь, благодаря FISH, возможна идентификация субмикроскопических делеции на уровне ДНК, что позволило выявлять наименьший делецированный регион, связанный с развитием того или иного синдрома, получивший название критического региона. После определения критического региона для синдрома зачастую становится возможным идентифицировать специфические гены, отсутствие которых признают ассоциированным с этим синдромом. В недавно вышедшем руководстве по синдромам генных последовательностей сообщают о 18 синдромах делеции и микроделеции, ассоциированных с 14 хромосомами. Некоторые наиболее часто встречающиеся синдромы генных последовательностей и их клинические проявления приведены в табл. 5-2.

Теломеры — образования, прикрывающие с концов длинные и короткие плечи хромосом. Они состоят из повторяющихся последовательностей TTAGGG и предотвращают слияние концевых участков хромосом между собой. Теломерные зонды играют важную роль в распознавании комплексных транслокаций, которые невозможно определить традиционными цитогенетическими методами. Кроме того, одним из открытий Проекта «Геном человека» был тот факт, что регионы хромосом, прилежащие к теломерам, богаты генами. В настоящее время показано, что субмикроскопические субтеломерные делеции ответственны за возникновение многих генетически обусловленных заболеваний.

- Вернуться в оглавление раздела "физиология человека"


Оглавление темы "Сперматогенез":
  1. Формирование сперматозоидов. Сперматоцитогенез и спермиогенез
  2. Цикл сперматогенеза. За какое время созревают сперматозоиды?
  3. Строение сперматозоидов. Структура
  4. Регуляция сперматогенеза. Факторы влияющие на формирование сперматозоидов
  5. Функции придатка яичка. Транспорт и хранение спермы
  6. Проникновение сперматозоидов через шейку матки. Капациитация и акросомальная реакция
  7. Геном человека. Один ген - один белок - справедливо ли?
  8. Гены и хромосомы человека. Строение
  9. Хромосомные аномалии. Аномалии количества и качества
  10. Флюоресцентная гибридизация in situ. Применение технологии FISH
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта