Методы выделения полирибосом. Размеры полирибосом синтезирующие антитела
В настоящее время для выделения полирибосом из лимфоидных тканей и миеломных опухолей обычно используют гомогенизацию их в трис-буферных растворах (рН 7,0—7,6), содержащих сахарозу, КСl (или реже — NaCl), MgCl2 (или ацетат магния) и какой-нибудь из ингибиторов РНКазы (чаще — гепарин). Необходимым условием является использование реактивов, не содержащих РНКазы. Из гомогената сначала удаляют ядра и митохондрии, к постмитохондриальному супернатанту добавляют какой-либо из детергентов (дезоксихолат натрия, или тритон Х-100), растворяющий мембраны энодоплазматического ретикулума, и полиробосомы осаждают (или фракционируют) в ступенчатом (0,5—1,5 М) или линейном (обычно 15—30%-ном) градиентах сахарозы. Выход полирибосомного материала составляет при этом 30—50% от числа всех клеточных рибосом.
На степень нативности полирибосом, получаемых из разных источников, влияют концентрация сахарозы, ионная сила и рН буферного раствора, соотношение K/Mg и природа используемого детергента. Так, для получения полирибосом из селезенки предпочтительнее использовать тритон Х-100, так как в присутствии дезоксихолата натрия отмечалась их деградация. В некоторых случаях рекомендуется также добавление небольших количеств СаС12, или спермидина, повышающих стабильность клеточных ядер (Горюнова и др., 1974; Wall е. а., 1977), и 2-меркаптоэтанола (Schechter, 1973). С целью сократить время контакта полирибосом с клеточным лизатом можно также сразу наносить клетки на содержащий ингибитор детергент, наслоенный прямо на сахарозный градиент. В этом случае при центрифугировании клеткп одновременно и лизируются, и фракционируются (Davis е. а., 1969).
Необходимо отметить, что выделение нативных полирибосом из клеток нормальных лимфоидных тканей или тканей иммунизированных животных является значительно более сложной и менее разработанной процедурой, чем выделение их из плазмоцитом. Возможно, это связано с тем, что в плазмоцитомах имеется эндогенный ингибитор РНКазы, в то время как в селезенке и лимфоузлах его нет, а активность РНКазы при иммунизации даже возрастает.
Существенную роль, по-видимому, играет и вид животного. Наиболее благоприятными объектами, по ряду данных, являются селезенка и лимфоузлы крысы, из которых удается получить нативные полирибосомы, седиментирующие при 250—350S и 160—190S и активно включающие пульсовую аминокислотную метку (Vassalli, 1967; Васильченко и др., 1969). Имеются также сообщения о выделении нативных полирибосом из селезенки кроликов (Becker, Rich, 1966; Scharff, Uhr, 1965) и морских свинок (Николаева, 1976). Из опухолевых тканей наиболее богатым источником полирибосом являются миеломы; в лимфомах количество этих органелл меньше (Sherr, Uhr, 1971a).
В результате усовершенствования техники фракционирования из лимфоидных тканей животных и клеток мышиных плазмоцитом удалось выделить широкий спектр полирибосом с константами седиментации от 118S до 350S. Было показано, что при иммунизации количество полирибосом в полтора-два раза возрастает (Moav, Harris, 1970; Юрин, 1971), а распределение их приобретает специфический бифазный характер. Аналогичные данные на клетках миелом были получены Шубертом (Schubert, 1968) и нами (Сидорова и др., 1973).
Возникло предположение, что бифазное распределение полирибосом, меченных по растущим полипептидным цепям, отражает наличие двух классов полирибосом, участвующих в синтезе Н- и L-цепей. Опытами с иммунопреципитацией полирибосом антисыворотками к Н- и L-цепям действительно было показано, что Н-цепи обнаруживаются только на полирибосомах 270-300S, а L-цепи — преимущественно на полирибосомах 180—190S (Shapiro e. a., 1966a; Askonas, Williamson, 1967b). Согласно проведенным авторами расчетам, такие полирибосомы должны были содержать мРНК, состоящие приблизительно из 1250 и 500 нуклеотидов, т. е. вполне пригодные для кодирования синтеза Н- и L-цепей.
Полученные данные позволили сделать два принципиально важных вывода, а именно: 1) синтез иммуноглобулинов носит моноцистронныи характер и 2) размеры полирибосом и мРНК, участвующих в образовании Н- и L-цепей, вполне достаточны для кодирования синтеза каждой из них как единого целого.
