MedUniver Физиология человека
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Физиология человека:
Физиология
Физиология клетки
Эндокринная система
Пищеварительная система
Физиология клеток крови
Обмен веществ. Питание
Выделение.Функции почек
Репродуктивная функция
Сенсорные системы
Физиология иммунной системы
Система кровообращения
Дыхательная система
Видео по физиологии
Книги по физиологии
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Метод поляризации флюоресценции антител. Корреляция иммуноглобулинов

Для решения вопроса о существовании независимого вращения субъединиц иммуноглобулинов большую помощь оказал метод поляризации флюоресценции. Основной подход, который использовался в этих опытах по изучению гибкости иммуноглобулинов, заключался в сравнении экспериментально определяемого времени корреляции молекулы иммуноглобулина, характеризующем найденное в опыте время выхода молекулы из плоскости поляризованного света, с временем корреляции, рассчитанным исходя из предположения о жесткости молекулы.

Так, если считать молекулу IgG жестким эллипсоидом вращения с соотношением осей 1:2 и молекулярным весом 150 000, время корреляции этой молекулы должно быть равным 73 нсек, а экспериментально наблюдаемое, как правило, было значительно меньшим: 20—40 нсек. Это указывает на способность фрагментов к независимому относительному перемещению и, следовательно, на гибкость связывающих их участков полипептидных цепей. Сходные данные были получены с помощью спиновых меток.

Стайер и Грифит (Stryer, Griffith, 1965) для определения времени корреляции спин-меченого гаптена, связанного с антителом, изучали поведение вещества, содержащего одновременно как флуорохромную группировку, так и спиновую метку в растворах различной вязкости.

Изменяя вязкость раствора добавлением глицерина, добивались совпадения его спектра ЭПР со спектром спин-меченого гаптена, связанного с активным центром. Затем методом поляризации флуоресценции определяли время корреляции. Найденное таким образом время корреляции N—О-группы связанного спин-меченого гаптена оказалось равным 12 нсек. При этом авторы справедливо отмечают, что это значение может быть занижено по сравнению с временем корреляции Fab-фрагмента, так как нельзя исключить возможность вращения имминоксилыюго кольца относительно динитрофенильной группы, жестко связанной с активным центром. Этот недостаток является общим для всех попыток определить время корреляции Fab-фрагмента IgG, используя спин-меченый гаптен.

исследование антител">

Хсиа и Пиетт (Hsia, Piette, 1969) для определения времени корреляции связанного с активным центром спин-меченого гаптена строили калибровочную зависимость спектров ЭПР от вязкости раствора спиновой метки. Время корреляции, соответствующее тому или иному спектру, определяли по закону Стокса — Эйнштейна, считая, что эффективный радиус Стокса метки равен 5 А. Самый короткий спин-меченый гаптен, наиболее жестко связанный с активным центром, имел время корреляции 39 нсек.

Двек и соавторы (Dwek е. а., 1975а) рассчитали время корреляции спин-меченого ДНФ, локализованного в активных центрах IgA (МОРС 315) и его Fab- и Fv-фрагмснтов. Оно оказалось равным 44,4, 23 и 6,5 нсек соответственно.

Получены кроличьи антитела непосредственно против спиновой метки 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-амино (N-дихлортриазина), служившей при иммунизации гаптеном. Результатом образования специфических комплексов антител, их пепсиновых и папанновых фрагментов со спиновой меткой была ее сильная иммобилизация. Смешивание соответствующих количеств растворов неспецифических кроличьих IgG и метки в аналогичных условиях приводило лишь к появлению спектра ЭПР свободной метки. Время корреляции меток рассчитывали по Шимшику и Мак-Коннелу (Shimshick, McConnell, 1972). Для комплексов спиновой метки с антителами, Fc- и Fab-фрагментами в области изоэлектрической точки (рН 6,3) оно оказалось равным 32, 30 и 18 нсек соответственно.
Полученные нами значения времени корреляции для IgG и Fab-фрагментов подтверждаются в упомянутой работе.

Различия во времени корреляции, полученные для Fab-фратмента, как изолированного, так и входящего в состав F(ab)2 и интактного антитела указывают на ограничения свободы вращения Fab-фрагментов, накладываемые взаимодействием субъединиц F(ab)2 и IgG. Повышение температуры приводило к уменьшению приведенного к стандартным условиям (3*105 П/°С) времени корреляции комплексов метки с F(ab)2 и IgG.

По-видимому, при нагревании свобода относительно перемещения их субъединиц возрастает. Возможность получения антител к спиновой метке, служившей при иммунизации гаптеном, подтверждена в другой работе (Humphries, McConnell, 1976).

- Читать далее "Гибкость иммуноглобулинов G и Е. Типы гибкости иммуноглобулинов"


Оглавление темы "Особенности формирования иммунных комплексов":
1. Метод поляризации флюоресценции антител. Корреляция иммуноглобулинов
2. Гибкость иммуноглобулинов G и Е. Типы гибкости иммуноглобулинов
3. Изменения молекул антитела. Конформация иммуноглобулинов
4. Модификация антитела после взаимодействия с антигеном. Комплементсвязывающие центры
5. Преципитат иммунных комплексов. Взаимодействие доменов в цепях антител
6. Конформенная модель иммунных комплексов. Взаимодействие антител с антигенами
7. Стабилизация иммуноглобулинов гаптенами. Зависимость конформации антител от температуры
8. Ассоциация иммунных комплексов. Механизмы диссоциации комплекса антитело-антиген
9. Антигенность иммуноглобулинов. Антигенные детерминанты антител
10. Внутривидовые различия иммуноглобулинов. Аллотипы антител
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта