Повышение точности косвенной ДНК-диагностики. Применение косвенной ДНК-диагностики
На практике для повышения точности и информативности косвенной ДНК-диагностики обычно используют несколько маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области. Таким образом, для каждой из хромосом можно установить и графически реконструировать последовательную серию аллелей изучаемых генетических маркеров. Такая комбинация аллелей различных локусов на одной хромосоме носит название гаплотип..
Косвенная ДНК-диагностика не ограничивается только заболеваниями, ген которых картирован, но не установлен. В настоящее время косвенная ДНК-диагностика широко используется также при заболеваниях, гены которых идентифицированы, но имеют большой размер и сложную молекулярную организацию, в связи с чем непосредственное определение мутаций в них чрезвычайно затруднено. Если ген заболевания известен, при проведении косвенной ДНК-диагностики могут использоваться как внешние сцепленные маркеры, так и внутригенные маркеры, непосредственно входящие в состав кодирующей области или интронов.
В качестве примеров заболеваний с установленными генами, при которых с успехом применяется косвенная ДНК-диагностика, можно назвать атаксию-телеангиэктазию, гепатоленти-кулярную дегенерацию, различные формы аутосомно-рецессивных прогрессирующих мышечных дистрофий и др.
Косвенный ДНК-анализ может применяться в качестве дополнительного диагностического метода у лиц из группы риска при отрицательных результатах традиционного мутационного скрининга. Так, папример, в семьях, имеющих одного больного ребенка с мышечной дистрофией Дюшенна/Бекера, пренатальная ДНК-диагностика болезни у плода при последующих беременностях может включать ряд последовательных молекулярных тестов [van Essen A. et al., 1997].
На первом этапе у пробанда проводится скрининг наиболее частых делеций в гене дистрофина с использованием мультиплексной ПЦР, а после обнаружения конкретной делеций исследуется ее наличие у плода. При отрицательном результате этого первого этапа ДНК-анализа далее может быть проведен Саузерн-блоттинг, позволяющий выявить ряд делеций, дупликаций или точковых мутаций, не выявляемых с помощью мультиплексной ПЦР; для поиска структурных или точковых мутаций может использоваться также анализ кДНК дистрофина, полученной из образцов тканей пробанда (лимфоциты, мышечные биоптаты), SSCP-анализ и другие скрининговые методы исследования кодирующей области гена.
Наконец, при невозможности обнаружения конкретных нуклеотидных изменений в гене проводится косвенная ДНК-диагностика с вне- или внутригенными маркерами, позволяющая оценивать сегрегацию патологического участка Х-хромосомы у матери, больного ребенка и плода и тем самым с высокой вероятностью определять генетический статус плода.
Данный пример хорошо иллюстрирует важнейший принцип молекулярно-генетической диагностики наследственных заболеваний - необходимость рационального сочетания различных методов, четкую последовательность выбора тех или иных процедур ДНК-анализа, определяемую особенностями строения гена и типичным спектром мутаций, характерным для каждого заболевания.
