MedUniver Неврология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Неврология:
Неврология
Аневризма сосуда мозга
Головная боль
Головокружение
Детская неврология
Комы
Менингит
Поражения ЦНС
Поражения подкорки
Мышечные боли
Лечение в неврологии
Шейный остеохондроз
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Использование рестрикционных эндонуклеаз. Модификации метода ПЦР

При проведении целенаправленного поиска конкретных точковых мутаций важная роль принадлежит использованию рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) - особых клеточных ферментов, выделяемых из различных штаммов бактерий. Ценным свойством рестрикционных эндонуклеаз является распознавание ими специфических нуклеотидных последовательностей длиной от 4 до 10 нуклеотидов, в результате чего фермент осуществляет рестрикцию, т.е. разрезапие этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК.

Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность - сайт рестрикции (сайт узнавания). В настоящее время известно уже несколько сотен различных рестриктаз и, следовательно, столько же различных вариантов коротких нуклеотидных последовательностей, образующих сайты рестрикции. В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный фрагмент ДНК; в некоторых случаях, напротив, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме. В обеих описанных ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе.

Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой-либо определенной точковой мутации задача сводится к компьютерному поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности; обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели.

Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

рестрикционные эндонуклеазы

Существует большое число модификаций метода ПЦР, разработанных для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций. Кратко упомянем некоторые из них.

1) Мультиплексная (мулътипраймерная) ПЦР - основана на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена, что позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций в гене [Chamberlain J. et al., 1988].

2) Аллель-специфическая амплификация - основана на использовании различных праймеров, один из которых комплементарен нормальной, а другой - мутантной последовательности ДНК; в результате такой реакции в растворе синтезируются две разновидности ПЦР-продуктов -нормальные и мутантные, различающиеся по своей длине [DvorakovaD., FajkusovaL., 1993].

3) Метод аллель-специфических олигонуклеотидов - основан на гибридизации амплифицированных фрагментов ДНК с мечеными олигонуклеотидами двух видов, комплементарными нормальной либо мутантной последовательности ДНК [Reiss J., 1991]. 4) Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК-основан на использовании в ПЦР mismatch-праймера, отличающегося от матричной последовательности на 1 нуклеотид [HaliassosA. etal., 1989]; в результате включения такого праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестриктаз, что позволяет провести ДНК-диагностику с помощью рестрикционного анализа.

- Читать далее "ПЦР-опосредованная прямая диагностика. Блот-гибридизации ДНК"


Оглавление темы "ДНК диагностика в неврологии":
1. Секвенирование ДНК. Обратная транскриптаза ДНК
2. SSCP-анализ. Мажорные мутации
3. Использование рестрикционных эндонуклеаз. Модификации метода ПЦР
4. ПЦР-опосредованная прямая диагностика. Блот-гибридизации ДНК
5. Количественная ПЦР диагностика. ДНК-биочип
6. Косвенная ДНК-диагностика. Техника и недостатки косвенной ДНК-диагностики
7. Повышение точности косвенной ДНК-диагностики. Применение косвенной ДНК-диагностики
8. Стратегия генетического картирования. Совершенствование молекулярных технологий
9. Проект геном человека. Генетическое картирование
10. Центральное положение linkage-анализа. Анализ сцепления генов
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта