Использование рестрикционных эндонуклеаз. Модификации метода ПЦР
При проведении целенаправленного поиска конкретных точковых мутаций важная роль принадлежит использованию рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) - особых клеточных ферментов, выделяемых из различных штаммов бактерий. Ценным свойством рестрикционных эндонуклеаз является распознавание ими специфических нуклеотидных последовательностей длиной от 4 до 10 нуклеотидов, в результате чего фермент осуществляет рестрикцию, т.е. разрезапие этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК.
Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность - сайт рестрикции (сайт узнавания). В настоящее время известно уже несколько сотен различных рестриктаз и, следовательно, столько же различных вариантов коротких нуклеотидных последовательностей, образующих сайты рестрикции. В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный фрагмент ДНК; в некоторых случаях, напротив, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме. В обеих описанных ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе.
Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой-либо определенной точковой мутации задача сводится к компьютерному поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности; обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели.
Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.
Существует большое число модификаций метода ПЦР, разработанных для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций. Кратко упомянем некоторые из них.
1) Мультиплексная (мулътипраймерная) ПЦР - основана на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена, что позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций в гене [Chamberlain J. et al., 1988].
2) Аллель-специфическая амплификация - основана на использовании различных праймеров, один из которых комплементарен нормальной, а другой - мутантной последовательности ДНК; в результате такой реакции в растворе синтезируются две разновидности ПЦР-продуктов -нормальные и мутантные, различающиеся по своей длине [DvorakovaD., FajkusovaL., 1993].
3) Метод аллель-специфических олигонуклеотидов - основан на гибридизации амплифицированных фрагментов ДНК с мечеными олигонуклеотидами двух видов, комплементарными нормальной либо мутантной последовательности ДНК [Reiss J., 1991]. 4) Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК-основан на использовании в ПЦР mismatch-праймера, отличающегося от матричной последовательности на 1 нуклеотид [HaliassosA. etal., 1989]; в результате включения такого праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестриктаз, что позволяет провести ДНК-диагностику с помощью рестрикционного анализа.
Видео методика и принципы ПЦР (полимеразной цепной реакции) в диагностике
