MedUniver Неврология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Неврология:
Неврология
Аневризма сосуда мозга
Головная боль
Головокружение
Детская неврология
Комы
Менингит
Поражения ЦНС
Поражения подкорки
Мышечные боли
Лечение в неврологии
Шейный остеохондроз
Рекомендуем:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Секвенирование ДНК. Обратная транскриптаза ДНК

Для обнаружения нуклеотидных замен в анализируемом участке гена возникает необходимость проведения секвенирования, т.е. определения точной нуклеотидной последовательности продуктов ПЦР. На практике наиболее широкое распространение получило секвенирование по классическому методу Сэнгера.

Изучаемый фрагмент ДНК (например, продукт ПЦР) играет роль матрицы, на которой при участии праймера, дезоксирибонуклеотид-трифосфатов и ДНК-полимеразы инициируется направленный комплементарный синтез новых молекул ДНК, осуществляемый одновременно в 4 параллельных реакциях. Смысл метода в том, что в каждую из реакций добавляется один из 4 химически измененных дезоксирибонуклеотид-трифосфатов (терминаторов). В качестве таких терминаторов выступают дидезоксирибонуклеотид-трифосфаты (ddGTP, ddATP, ddTTP и ddCTP), которые при встраивании в состав молекулы ДИК обрывают дальнейший синтез полинуклеотидной цепи. В результате этого в каждой из пробирок накапливастся набор дочерних молекул ДНК различной длины, оканчивающихся строго на один и тот же нуклеотид.

После электрофореза продуктов этих реакций в 4 соседних дорожках проводится считывание информации от более коротких фрагментов к более длинным, при этом выявляемый пошаговый порядок удлинения цепей и отражает последовательность нуклеотидов в составе анализируемой ДНК-матрицы. Одномоментно может быть секвенирован участок ДНК, не превышающий 500 п.о., поэтому для исследования более длинных участков гена они должны быть амплифицировапы в виде совокупности и коротких перекрывающихся фрагментов, каждый из которых секвенируется отдельно. Обычно для обнаружения мутаций секвенируются отдельные экзоны изучаемого гена вместе с примыкающими к ним интронными последовательностями (областями сплайсинга).

транскриптаза днк

В некоторых случаях в качестве объекта исследования удобнее использовать не геномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т.д. Для этого используется методика обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR): проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для полимеразной цепной реакции.

В последующем кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электрофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т.д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа. Последний метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) - так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test) [Telatar M. et al., 1996].

РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера, атаксии-телеангиэктазии или нейрофиброматоза 1-го типа.

- Читать далее "SSCP-анализ. Мажорные мутации"


Оглавление темы "ДНК диагностика в неврологии":
1. Секвенирование ДНК. Обратная транскриптаза ДНК
2. SSCP-анализ. Мажорные мутации
3. Использование рестрикционных эндонуклеаз. Модификации метода ПЦР
4. ПЦР-опосредованная прямая диагностика. Блот-гибридизации ДНК
5. Количественная ПЦР диагностика. ДНК-биочип
6. Косвенная ДНК-диагностика. Техника и недостатки косвенной ДНК-диагностики
7. Повышение точности косвенной ДНК-диагностики. Применение косвенной ДНК-диагностики
8. Стратегия генетического картирования. Совершенствование молекулярных технологий
9. Проект геном человека. Генетическое картирование
10. Центральное положение linkage-анализа. Анализ сцепления генов
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта