Успехи в области изучения механизма действия ФОС послужили основной предпосылкой для более глубокого понимания проблемы связи их эффектов со строением. Вначале была установлена роль отдельных химических группировок в молекуле соединений типа (ROb(S)X, где R=CH3, С2Н5, iС3Н7; X — кислотный остаток. Было показано, что наибольшей токсичностью обладают соединения, в которых фосфор связан с двумя этоксильными группами. Метоксильные аналоги оказались менее токсичными, чем этоксильные, в 4—12 раз. Токсичность веществ, в которых фосфор связан с двумя пропилокси- и изопропилоксигруппами, значительно снижается по отношению к токсичности веществ, в структуре которых имеются метокси- или этоксигруппы.
В условиях in vitro антихолинэстеразная активность диметиловых эфиров находилась на уровне диэтиловых эфиров либо была несколько меньшей. Замена этоксильных групп на изопропилоксильные либо не изменяла антихолинэстеразную активность вещества, либо повышала ее.
В организме животных антихолинэстеразная активность диэтиловых эфиров значительно выше, чем метиловых. Различия в антихолинэстеразной активности и токсичности диметиловых и диэтиловых эфиров кислот фосфора связаны с неодинаковой стойкостью их фосфорилированного энзима в организме животных. Связь диэтилфосфорила с энзимом оказалась более прочной, чем диметилфосфорила, что и обусловило большую антихолинэстеразную активность и токсичность этиловых эфиров, чем метиловых.
Таким образом, следует полагать, что скорость гидролиза диалкилфосфорилированной ХЭ в организме является одним из ведущих факторов, обусловливающих большую токсичность для теплокровных животных диэтиловых эфиров кислот фосфора по сравнению с диметиловыми.
Замена этилоксигруппы на изопропилоксигруппу в молекуле тиофторфосфонатов вызывает небольшое понижение токсичности, а замена на фенилоксигруппу снижает токсичность в несколько раз. Введение фенилоксигруппы в молекулу тиофторфосфонатов вместо парахлорфенильной группы приводит к резкому снижению токсичности.
Так, величина токсичности LD50 препарата К4, имеющего в своей структуре этилоксигруппу, составляет 6,4 мг/кг, препарата К1 (с изопропилоксигруппой) — 9,6 мг/кг, препарата К^ (с фенилоксигруппой) — 44 мг/кг, препарата К5 (с пара-хлорфенильной группой) — 2400 мг/кг. Изменение антихолинэстеразной активности у данных соединений in vitro происходило в противоположном направлении. Антихолинэстеразная активность препарата К5 была в 7,2 раза выше, чем у препаратов К4 и К2.
По данным Н.Н.Годовикова, ингибирующее действие О-этил-S-R-бутилметилтиофосфонатов типа CH3(RO)P(0)SC4H9 по отношению к бутирилхолинэстеразе значительно увеличивается (в 18 000 раз) при удлинений О-алкильного радикала от метального до гептильного.
Повышение значений константы скорости взаимодействия К2 происходило неравномерно. При взаимодействии с АХЭ удлинение О-алкильного радикала данного типа соединений сопровождалось увеличением К2 лишь при переходе от метильного к бутильному производному. При дальнейшее увеличении R-антихолинэстеразная активность несколько уменьшалась и колебалась в незначительных пределах. Поскольку электрофильная фосфорилирующая активность (рКа) практически одинакова, полагают, что изменения К2 связаны с изменением способности ФОС к образованию ферментсубстратного комплекса. В связи с этим можно считать, что антихолинэстеразная способность ФОС связана с гидрофобной сорбцией и зависит от длины О-алкильного радикала. Поскольку гидрофобная сорбция ФОС на АХЭ менее выражена, чем на БуХЭ, то и ингибирующая способность в отношении АХЭ наблюдается в меньшей степени.
Таким образом, способность ФОС ингибировать ХЭ зависит в значительной степени от характера группировок, связанных с атомом фосфора, которые не отщепляются в процессе фосфорилирования фермента. Величина и степень разветвленности алкоксильных, алкильных, диалкиламидо- и других группировок сильно влияют на способность к образованию ферментингибиторного комплекса и антихолинэстеразную активность ФОС.