Аттенуация вируса гриппа. Свойства аттенуированного вируса гриппа.
Вирулентные штаммы вируса гриппа, в отличие от авирулентных, имеют протеолитически расщепленный НА, что зависит, по-видимому, от наличия основных аминокислот у С конца НА-1, которые распознаются клеточными протеазами. Инфекционная форма вируса гриппа с расщепленным НА при инфекции млекопитающих образуется только в поверхностных клетках дыхательного тракта.
Аттенуация вируса гриппа А птиц также связана с изменением его НА. Репродукция вирулентных штаммов вируса гриппа кур сопрождалась расщеплением НА, тогда как размножение авирулентных штаммов нуждалось в экзогенном трипсине. В отличие от вирулентного штамма, вызывающего у кур системное поражение органов, включая лимфоидные ткани, его аттенуированный вариант не поражал лимфоидные ткани. Мутации в гене, гемагглютинина вируса гриппа А птиц сопровождались аттенуацией вируса, связанной с изменением его клеточного тропизма.
Различия авирулентных штаммов вируса ньюкаслской болезни связаны с изменениями в структуре HN-гена, кодирующего гемагглютинин-нейраминидазу. Большинство аминокислотных замен располагалось в четырех участках N'-kohца HN белка. Имеются данные, свидетельствующие о связи вирулентности вируса ньюкаслской болезни и вируса Сендай с расщеплением гликопротеи-на слияния (белок Fo) клеточными протеазами или изменением других свойств белков F и HN.
Нуклеотидная дивергенция в гене НА аттенуированного штамма вируса чумы крупного рогатого скота в 3'-концевом некодирующем участке генома была более выраженной, чем внутри кодирующей области. Вакцинный штамм RA 27/3 вируса краснухи отличался от исходного вирулентного штамма заменой 31 аминокислотного остатка в капсидном белке и в гликопротеине Е-1 — 12 заменами, Е-2 — семью заменами.
Негемагглютинируюший мутант парвовируса собак отличался от исходного «дикого» штамма мутацией генов, кодирующих поверхностные белки VP1 и VP2. Адаптация буньявирусов к клеткам комаров сопровождалась изменением гликопротеинов оболочки вируса и чувствительности к нейтрализующему действию моноклинальных антител. Важная роль в определении спектра биологических переносчиков арбовирусов принадлежит наружным белкам вириона, участвующим в прикреплении вируса к поверхности клеток хозяина.
С помощью нейтрализующих моноклональных антител из популяции вирулентного вируса бешенства удается селекционировать варианты с измененным вирус реплицировался только в верхних дыхательных путях и инактивировался в других органах. При испытаниях на кошках в экспериментальных условиях из 20 вакцинированных животных после контрольного заражения заболело три, а в группе не-вакцинированных — все 12, из них погибли 10. У вакцинированных животных образовались сывороточные и секреторные нейтрализующие антитела, а также развился клеточный иммунный ответ. Полевые испытания подтвердили безопасность и эффективность вакцинации.
Первый аттенуированный штамм вирус гепатита А получен путем серийного пассирования в культуре клеток при пониженной температуре. Он прошел 15 пассажей в культуре клеток почек обезьяны при 35°С, пять пассажей при 32°С и четыре пассажа — в диплоидных клетках почки человека. Штамм потерял способность заражать обезьян оральным путем, сохранив иммуногенность. Недостатком вакцины являлась потенциальная опасность реверсии с возможной передачей вакцинного штамма по контакту. Аттенуированный штамм отличался от исходного вирулентного вируса заменой 25 нуклеотидов. В том числе в 5'-концевой некодирующей области генома обнаружено семь замен и пять де-леций. Из 12 замен аминокислотных остатков только одна обнаружена в белке VP1.
Аналогичный штамм получен при пассировании полевого штамма вируса (НМ175) в культуре клеток AGMK при 35°С 32 раза. Вакцинный штамм Н2 аттенуирован пассированием в культуре клеток почки новорожденных обезьян, а затем в фибробластах легких человека (КМВ17). Вакциной из этого штамма привито более 20 млн человек в Китае — с хорошей эффективностью. Вирус не выделялся из организма привитых и не обнаружил реверсии.
Вакцинный штамм GPE — вируса классической чумы свиней (КЧС) — получен пассированием штамма ALD в разных клеточных культурах при 30°С. Он прошел 142 пассажа в культуре клеток тестикул свиней и клонирован методом предельных разведений, 36 пассажей в культуре клеток тестикул крупного рогатого скота — и вновь клонирован тем же методом, затем 41 пассаж в культуре клеток почки морской свинки. Вакцинный штамм GPE-, в отличие от исходного вирулентного штамма, хорошо размножался в культуре клеток морской свинки (G-маркер) при 30°С и плохо при 40°С (Т-маркер). Испытание на поросятах подтвердило его безопасность и высокую иммуногенную активность. Геном штамма GPE-отличался от родительского заменой 225 нуклеотидов. На его основе создали GPE-вакцину, которая успешно применяется в Японии.
Штамм Tiverval вируса КЧС получен из вирулентного штамма Альфор после более чем 170 серийных пассажей в культуре клеток при 29—30°С и его можно идентифицировать несколькими маркерами in vitro. По безопасности и иммуногенности он подобен другим вакцинным штаммам вируса КЧС.
В качестве живой вакцины против ящура испытывали «холодный» вариант вируса тип O1, который прошел 120 пассажей в первичной культуре клеток почки телят при 24°С. При испытании в лабораторных условиях штамм (О, — 24°-120) обнаружил аттенуированный фенотип. Он оказался авирулентным для КРС, морских свинок и 7-мидневных мышей, не передавался горизонтально и вызывал иммунитет. Сухая вакцина из этого штамма была испытана на серонегативном КРС (более 7 000 голов) в двух республиках СССР в зоне с умеренным климатом, в летний период (температура воздуха +20 +30°С).
Результаты этих испытаний полностью подтвердили результаты лабораторных исследований. Однако прививка этой вакциной КРС в зимний период при содержании практически на открытом воздухе при температуре — 25—30°С вызывала осложнения у 7 из 96 животных, связанные с реверсией вирулентности аттенуированного штамма. Причиной реверси, вероятно, явилось резкое понижение температуры конечностей, особенно в области копыт, где вирус ящура обычно размножается в естественных условиях. Вьщеленныи от вакцинированных животных вирус сохранял некоторые исходные свойства: размножался при 24°С и не вызывал гибели новорожденных мышей. Полученные результаты демонстрируют пример реверсии in vivo, зависящий от температуры.
