MedUniver Микробиология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Микробиология:
Общая микробиология
Общая бактериология
Экология микробов
Учение об инфекции
Лечение инфекций
Иммунология
Методы диагностики
Грам "+" бактерии
Грам "-" бактерии
Микобактерии
Хламидии. Риккетсии
Спирохеты. Трепонемы
Вирусы
Грибы
Простейшие
Гельминтозы
Санитарная микробиология
Книги по микробиологии
Рекомендуем:
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Особенности суспензий постоянных линий клеток. Выращивание вирусов в суспензии постоянных линий клеток.

Многолетние исследования по оптимизации условий выращивания клеток ВНК-21 в суспензии увенчались еще одним важным достижением. Радлетт и сотрудники предложили среду 7М, которая обеспечивала исключительно высокое накопление клеток ВНК-21 (6,5—7,0x106/мл) в суспензии.

При начальной концентрации клеток около 5x105 мл культура вступала в экспоненциальную фазу роста через 10—12 ч. В этот период продолжительность генерации составляла около 14 ч (константа скорости роста 0,05 ч). Наиболее критическими факторами, ограничивающими рост клеток, оказались глютамин и глюкоза, содержание которых в новой среде было повышено до оптимального уровня. Добавление гидролизата лактальбумина (5 г/л) повышало концентрацию глютамина в среде до 10—12 мМ.

Поскольку глютамин в концентрации более чем 10 мМ (1,46 г/л) оказывает цитотоксический эффект, авторы считают целесообразным добавлять его в среду дозировано, периодически, по мере ее истощения.

При промышленном выращивании различных типов вирусов ящура в суспензии клеток ВНК-21 с успехом применяли среду Игла с добавлением 0,3% триптозофосфатного бульона и 8% сыворотки крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ-6000. В 300-литровом ферментере при 37 °С, рН 7,3 и скорости перемешивания 100 об/мин через 24—48 ч концентрация клеток повышалась с 0,4—0,9 млн/мл до 1,6—2 млн/мл. Заражение таких культур позволило регулярно получать качественное сырье (229 партий из 231) для изготовления вакцины.

размножение вирусов в линии клеток

Несмотря на высокую производительность, культивирование вируса ящура в суспензии клеток ВНК-21 имеет два недостатка: необходимость смены среды перед заражением вирусом и включение в ее состав сыворотки. Первый обременяет технологический процесс, второй может быть причиной анафилактических осложнений при вакцинации.

Кроме клеток ВНК-21 для культивирования вируса ящура в последнее время была использована постоянная линия клеток почки поросят IBRS-2, адаптированная к суспензионному культивированию. Клетки выращивали при рН 7,4, температуре 36,5°С и непрерывном перемешивании суспензии (350 об/мин). Через 48 ч культивирования концентрация клеток повышалась более чем в 3 раза. Эти клетки оказались высокочувствительными к вирусу ящура. Максимальное накопление вируса (7,7-8,7 lg ТЦД50/мл) в суспензии клеток IBRS-2 наблюдали через 18-24 ч после заражения, а КС-антигена - через 32-48 ч.

Инактивированная вакцина, приготовленная из такого вируса, имела хорошую иммуногенность и не уступала инактивированной вакцине из вируса ящура, размноженного в суспензии клеток ВНК-21 (при равном титре инфекционности и активности КС-антигена). В силу выраженной способности вируса ящура к мутациям, его популяция в процессе репликации в культуре клеток (ВНК-21 или IBRS-2) в течение небольшого количества пассажей представляет собой смесь генетических вариантов.

Суспензию клеток IBRS-2 использовали для размножения вируса везикулярной болезни свиней. Клетки выращивали в среде Игла с триптозо-фосфатным бульоном (0,2%) и 10% сыворотки телят. При заражении вирусом концентрацию сыворотки снижали до 5%. В суспензию клеток (106 клеток/мл) вносили вирус (М=10) и инкубировали при 35°С, рН 7,2. Вирус максимально накапливался (10м БОЕ/мл) через 16-24 ч.

Технология культивирования клеток ВНК-21 в реакторах емкостью 1000 л, разработанная для получения вируса ящура, оказалась весьма перспективной для промышленного производства инактивированной вакцины против бешенства из штамма Lep Flyry.

Клейн и сотрудники описали размножение вируса лихорадки долины Рифт в суспензионной культуре клеток L. Клетки хранили при —175°С и выращивали поэтапно, вначале во встряхиваемых колбах и стеклянном ферментере емкостью 7,5 л, затем в 50-литровом металлическом реакторе. Клетки выращивали в модифицированной минимальной среде Игла с 10% сыворотки крупного рогатого скота; рН 7,0±0,1 поддерживали на этом уровне добавлением кислоты или щелочи, а ОВП 75 mV — автоматически с помощью аэрации (95% 02 + 5% С02 или 95% воздуха + 5% С02). Газ подавали под мешалку турбинного типа (100 мл/мин) или над поверхностью жидкости (500 мл/мин).

Двойная аэрация сопровождалась лишь небольшим образованием пены и устраняла необходимость применения пеногасителя. При разбавлении суспензии клеток свежей средой (1:10) через пять дней их концентрация достигала максимального значения — 2,5х106 мл. Поскольку вирус наиболее интенсивно размножался в делящихся клетках, то их рассевали, когда плотность популяции приближалась к 2x106 клеток/мл. При этом поступали следующим образом. Ростовую среду вносили в реактор, устанавливали температуру 25°С, добавляли клетки (Зх105/мл), вносили вирус (М=1), устанавливали рН 7,4±0,1; ОВП на 75 mV и повышали температуру до 37°С постепенно, в течение 4—6 ч (для лучшего сохранения жизнеспособности клеток). Через 48—72 ч после заражения вирус накапливался в максимальном титре 8,0—9,0 lg ЛД50/мл.

Суспензионная культура постоянной линии клеток простаты человека (MAI 60) обеспечивала репликацию штамма Эдмонстон вируса кори на высоком уровне. Выход его составлял 150—800 БОЕ на клетку и примерно в 25 раз превышал выход вируса в однослойной культуре.

- Читать далее "Опыт культивирования вирусов в суспензиях постоянных линий клеток. Технологии в вирусологии."


Оглавление темы "Культивирование вирусов. Антигены вирусов и иммуннитет.":
1. Культуры клеток на микроносителях. Применение культуры клеток на микроносителях в вирусологии.
2. Суспензии постоянных линий клеток. Размножение вирусов в суспензии постоянных линий клеток.
3. Особенности суспензий постоянных линий клеток. Выращивание вирусов в суспензии постоянных линий клеток.
4. Опыт культивирования вирусов в суспензиях постоянных линий клеток. Технологии в вирусологии.
5. Вирусные антигены. Виды антигенов у вирусов.
6. Ответ организма на антигены вируса. Антитела на антигены вируса.
7. Нейтрализирующие антигенные участки вируса. Гликопротеины вируса.
8. Тип репродукции вируса и его антигенный состав. Инфекционность и тип репродукции вируса.
9. Противовирусный иммунитет. Вирусы и иммунная система.
10. Структура иммунной системы. Организация иммунной системы.
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта