MedUniver Микробиология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Микробиология:
Общая микробиология
Общая бактериология
Экология микробов
Учение об инфекции
Лечение инфекций
Иммунология
Методы диагностики
Грам "+" бактерии
Грам "-" бактерии
Микобактерии
Хламидии. Риккетсии
Спирохеты. Трепонемы
Вирусы
Грибы
Простейшие
Гельминтозы
Санитарная микробиология
Книги по микробиологии
Рекомендуем:
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Культуры клеток на микроносителях. Применение культуры клеток на микроносителях в вирусологии.

Культуры клеток на микроносителях (МН) оказались весьма перспективными при производстве вирусных вакцин, а также других продуктов клеточного и вирусного происхождения. Этот метод широко применяют в биологической промышленности многие высокоразвитые страны. Культуры различных клеток на микроносителе оказались достаточно эффективными для выращивания многих опасных вирусов человека и животных.

Этим методом размножают вирус полиомиелита в первичной культуре клеток почки обезьяны и в клетках Vero, вирусы бешенства и кори в первичной культуре клеток почки собаки, вирус краснухи в клетках ВНК-21, ящура в клетках TBRS-2 и ВНК-21, вирус гриппа и Синдбис в клетках МДСК и ВНК-21, вирус простого герпеса в клетках HeLa, MRC-5, Vero и RK-13. Поданным некоторых авторов, выход вируса (на одну клетку) одинаков в культурах клеток, выросших в статических условиях или на микрогранулах. Коллагеновые микросферы активируют клеточную дифференциацию, синтез белков и их секрецию.

При выращивании вирусов в культуре клеток с микроносителем необходимо учитывать способность их к цитолизу. Если вирус быстро разрушает клетки, то заражение следует производить в период максимальной плотности жизнеспособных клеток, если он медленно или совсем не разрушает клетки, то его рекомендуют вносить за несколько суток до этого срока. Метод культивирования клеток на микроносителях применяют при изготовлении ряда вакцин против полиомиелита, краснухи, бешенства, герпеса простого (тип 2), гриппа, ящура. Некоторые из них, например, вакцины против полиомиелита, бешенства, ящуpa готовили в промышленных масштабах для широкого практического использования. Вакцину против полиомиелита первоначально готовили с использованием первичной культуры клеток почки обезьян, выращенной на микроносителе ДЭАЭ-сефадекса А-50 в культиваторах емкостью 40— 135 л.

За 7—8 суток выращивания численность клеточной популяции увеличивалась в 8—10 раз, а концентрация достигала 106 клеток/мл. В таких культурах вирус полиомиелита накапливался в высоком титре (8,1—8,3 lg ТЦД50/мл). Положительные результаты получены при выращивании полиовируса в субкультурах клеток почек обезьян с использованием цитодекса в качестве микроносителя и культиваторов емкостью до 650 л. Проведение 2-3 пассажей клеток почек обезьян экономило дорогостоящее первичное сырье и упрощало технологию выращивания вируса.

В дальнейшем была изыскана возможность замены первичных культур клеток почки обезьян постоянными линиями клеток. Представилась возможность размножения различных типов вируса полиомиелита в трех постоянных линиях клеток почек обезьяны: LLC-MK2, Vero и CV-1, выращенных в культуре на микроносителе. На основе таких вирусов изготовлена инактивированная полиовакцина. В ферментерах получали культуру клеток с концентрацией 106 клеток/мл. Выход вируса был не ниже, чем в однослойной первичной культуре клеток почек обезьяны, и выше, чем в однослойной статической культуре гомологичных клеток. В дальнейшем было установлено отсутствие вирусной контаминации или туморогенных свойств клеток Vero. Разработан метод культивирования клеток Vero нацитодексе-1 (1,5 г/л) в объеме 1000 л для размножения полиовируса I, II и III типов.

размножение вирусов и их строение

В настоящее время клетки Vero считают наиболее перспективными и экономичными при крупномасштабном производстве полиовакцины вакцины на микроносителях. Для производства инактивированных полиовирусных и других вакцин во Франции клетки на микроносителе выращивали в реакторах емкостью 2000 и 6000 л. При культивировании со сменой среды плотность популяции достигала 2,2x107 клеток/мл.

Вирус бешенства для изготовления инактивированной антирабической вакцины выращивали в первичной культуре клеток почки собаки на микроносителе. Поскольку вирус бешенства медленно разрушает клетки, то на одной культуре получали несколько урожаев вируса при замене среды через каждые 4—5 суток. Титр инфекционности указанного вируса составил 6,0+1,0 lg ИД50/мл. При крупномасштабном производстве инактивированной вакцины против бешенства используют постоянную линию клеток Vero, которую размножают на микроносителе в суспензии с использованием возрастающего объема 150—500—1000 л. При заражении вирусом используют среду без сыворотки. Сбор вируса производят многократно через каждые 3—4 дня. Вирус концентрируют, инактивируют бета-пропиолактоном (БПЛ) и очищают.

Вирус ящура выращивали в постоянной линии клеток почки свиньи (IBRS-2) на микроносителе в ферментерах емкостью 150—235 л. Выход клеток был в 3 раза большим, чем в статической культуре во флаконах. Аналогичным образом вирус ящура выращивали в клетках ВНК-21 на микроносителе. Инфекционная и комплементфиксирующая активность вируса ящура типов А и О была выше при выращивании клеток на микроносителях, чем во вращающихся флаконах. При культивировании вируса ящура в клетках ВНК-21 на микроносителе отмечено повышение выхода клеток и вирусного антигена, а также повышение иммуногенности инактивированной вакцины. В культуре клеток ВНК-21 (клон 13) на микроносителе выход вируса ящура был выше (9,5 lg ТЦД50/мл), чем в роллерной культуре (8,5 lg ТЦД50/мл) [699]. Хорошее накопление вируса краснухи получено в культуре клеток ВНК-21 на микроносителе.

Вирус панлейкопении кошек выращивали в культуре перевиваемых клеток легких эмбриона кошки. Инфицированную культуру инкубировали до полного разрушения клеток на микроносителе под действием вируса. Приготовленная из него инактивированная вакцина обладала выраженной иммуногенностью.

Пролиферативная активность многих клеток (фибробласты куриного эмбриона, клетки яичника китайского хомяка — СНО, клетки почки обезьяны и диплоидные W-1-38) была выше при культивировании на микроносителях, чем в роллерных флаконах. Опыты, проведенные с полиовирусом и вирусом Синдбис, показали, что выход последнего в расчете на одну клетку куриного эмбриона в роллерной культуре был выше, чем в культуре на микроносителе. Однако титр обоих вирусов во всех культурах клеток на микроносителе неизменно был выше, чем в культурах тех же клеток во вращающихся флаконах. Это связано с большей концентрацией клеток на единицу объема среды в первом случае, чем во втором.

Клетки линии FLK, инфицированные вирусом лейкоза крупного рогатого скота, выращенные на микроносителе, длительно сохраняли жизнеспособность и поддерживали продукцию вирусного антигена.

Респираторно-синцитиальный (PC) вирус крупного рогатого скота хорошо размножался в первичной культуре тестикулярной ткани телят на микроносителе (6,0 lg ИД50/мл). В результате периодической смены среды можно получить несколько урожаев вируса. PC-вирус крупного рогатого скота выращивали в культуре перевиваемых клеток слизистой оболочки носа крупного рогатого скота (линия М-57) в однослойной статической культуре и на микроносителе. Урожай клеток в культуре на микроносителе (цитодекс 3; 1,5 г/мл) был в 3 раза выше, чем в однослойной пристеночной культуре. В конечном счете в первом случае культуральная система оказалась значительно продуктивнее и экономичнее для получения вируса, чем во втором. Микроносители были использованы для выращивания клеток насекомых и репродукции арбовирусов.

Технология крупномасштабного производства гликопротеина 160 кД (gp 160) ВПГ-1 разработана с использованием клеток Vero, выращенных на микроносителе в культиваторах емкостью 40 л. Максимальный выход gp 160 наблюдали через 40 ч после заражения клеток (106/мл) рекомбинантным вирусом вакцины. Из одного ферментера после очистки получали 50 мг белка gp 160, обладающего выраженной иммуногенностью.

Коронавирус мышей выращивали в культуре клеток мышей (линия ДВТ), используя в качестве микроносителя Цитодекс 1 в концентрации 5 г на 1 л среды L=15 с 5% сыворотки плодов крупного рогатого скота. В течение семи дней культивирования концентрация клеток повышалась примерно в 10 раз (3х106 мл). Выход вируса на одну клетку был таким же как и в статической однослойной культуре.

Вирус болезни Ауески размножали в постоянной линии клеток (NLST) тес-тикулярной ткани свиней, выращенной на микроносителе в реакторе емкостью 500 л. Накопление клеток вируса и его антигена было более высоким в суспензионной, чем в статической однослойной культуре.

При массовом использовании продуктов, полученных с применением производных декстрана (ДЭАЭ-сефадекса А-50, цитодексов), необходимо знать, остаются ли в них какие-то количества ДЭАЭ-декстрана. Масс-спектроскопическими исследованиями не установлено наличие ДЭАЭ-декстрана в суспензии по-лиовируса, выращенного на микроносителе.

- Читать далее "Суспензии постоянных линий клеток. Размножение вирусов в суспензии постоянных линий клеток."


Оглавление темы "Культивирование вирусов. Антигены вирусов и иммуннитет.":
1. Культуры клеток на микроносителях. Применение культуры клеток на микроносителях в вирусологии.
2. Суспензии постоянных линий клеток. Размножение вирусов в суспензии постоянных линий клеток.
3. Особенности суспензий постоянных линий клеток. Выращивание вирусов в суспензии постоянных линий клеток.
4. Опыт культивирования вирусов в суспензиях постоянных линий клеток. Технологии в вирусологии.
5. Вирусные антигены. Виды антигенов у вирусов.
6. Ответ организма на антигены вируса. Антитела на антигены вируса.
7. Нейтрализирующие антигенные участки вируса. Гликопротеины вируса.
8. Тип репродукции вируса и его антигенный состав. Инфекционность и тип репродукции вируса.
9. Противовирусный иммунитет. Вирусы и иммунная система.
10. Структура иммунной системы. Организация иммунной системы.
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта