Применение однослойных клеточных культур. Выращивание вируса в однослойной культуре.
Одновременно заражали 2000 флаконов с 6-дневной культурой. В каждый сосуд вносили по 40 мл вируссодержащей ростовой среды (0,01- 0,05 БОЕ на 1 клетку) с 1,5% сыворотки и инкубировали при 37°С в течение 24 ч при постоянном вращении (2 об/ч). Вирус ящура накапливался в титре около 5х108 БОЕ/мл, а выход его составлял 30—50 БОЕ на 1 клетку.
В Италии клетки ВНК-21 предварительно выращивали (в течение 48 ч) в перемешиваемой суспензии в реакторе (емкостью 50 л), разбавляли питательной средой и высевали в 1 -литровые вращающиеся флаконы. В зависимости от посеянной дозы клеток культуры выращивали 3—5 дней. В каждый флакон (около 2,5x108 клеток) вносили 70 мл среды ГЛА с вирусом ящура (0,05 ТЦД50 на клетку).
Вирусную суспензию собирали через 20—24 ч при достижении максимального титра (107,5-108,5 ЛД50/мл).
В 1968 г. для изготовления инактивированной вакцины против ящура было использовано 832 170 флаконов с однослойной культурой клеток ВНК-21. В течение более 20 лет на промышленных роллерных установках Италии выпущены миллиарды доз вакцин против ящура, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3 и болезни Ауески. Вращающиеся культуры различных клеток также широко использовали для производственного выращивания вирусов герпеса, бешенства, кори, осповакцины, краснухи и др.
Для приготовления инактивированной вакцины против восточного энцефаломиелита лошадей был разработан метод выращивания вируса в однослойной первичной культуре клеток куриных эмбрионов во вращающихся флаконах. В каждый флакон с полезной площадью 840 см2 вносили 170 мл среды Игла, 1% глютамина и 10% сыворотки телят и 4-106 клеток/мл трипсинизированных тканей 9-дневных куриных эмбрионов. Сплошной слой клеток формировался через 18-24 ч выращивания при 35°С. В этот период производили смену среды и заражение вирусом.
Во флаконы с культурой вносили по 300 мл среды с 0,25 % сывороточного альбумина и 0,005 - ЛД50 вируса на клетку. Через 18-24 ч выращивания при 35°С концентрация вируса была максимальной и нередко достигала 1010 ЛД50/мл. Приготовленная из этого вируса формолвакцина обладала высокой иммуногенностью.
В статической однослойной культуре постоянной линии клеток РК-15 вирус классической чумы свиней накапливался в титре 6,3 lg ТЦД50/мл, тогда как в культуре на микроносителе он достигал 9,0 lg ТЦД50/мл.
Аттенуированный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножали в роллернои культуре постоянной линии клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ). Для выращивания вируса использовали культуры, образовавшие монослой клеток через 40-48 ч. Вирус перед заражением обрабатывали трипсином (5 мкг/мл, при 37°С, в течение 30 мин) и вносили в культуру из расчета 10 ТЦД50 на 1 клетку. Инфицированные культуры инкубировали при 37°С в течение 16-20 ч и замораживали при - 20°С.
При серийном пассировании в указанных условиях вирус регулярно накапливался в титре 108— 109 ТЦД50/мл. Аналогичная методика, примененная ранее для культивирования ротавируса свиней, а затем и респираторного коронавируса свиней, позволила получить культуральные препараты этих вирусов с высоким титром.
Ротавирус крупного рогатого скота серийно размножали в постоянной линии клеток свиньи (линия СПЭВ) в присутствии трипсина. Размножение его сопровождалось слабым ЦПЭ. Репродукция вируса была больше выражена в роллернои культуре, чем в статической.
Для производства вакцины против болезни Марека используют фибробласты эмбрионов кур или перепелов, которые обычно культивируют в круглостенных сосудах на роллерных установках.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности метода вращающейся культуры клеток в приготовлении вирусных биопрепаратов. Большим шагом вперед в технологии выращивания однослойных культур стала разработка таких аппаратов как многопластинчатые или многотрубчатые культиваторы, применение которых обеспечило одновременное выращивание большого количества клеток на твердом субстрате в одном культуральном сосуде. В однослойной культуре, выращенной в многопластинчатом культиваторе, вирусы гриппа и другие накапливались в таком же титре, как и в однослойной статической культуре в матрасах Ру.
После образования монослоя в культиватор вносили поддерживающую среду с вирусом. При инкубировании проводили медленное перемешивание и аэрацию поддерживающей среды. Культуральную жидкость собирали в период максимального накопления вируса. Во время выращивания вируса обработанную газовую смесь обеззараживали с помощью специальной установки. Разработанные культиваторы с титановыми пластинами с успехом заменили вращающиеся бутыли при производстве вакцин против эпидемического паротита (свинки), кори и краснухи.
Для производственного выращивания клеток и вирусов были предложены многотрубчатые культиваторы, представляющие собой цилиндрический горизонтально расположенный сосуд из нержавеющей стали, заполненный массой стеклянных трубок, расположенных параллельно продольной оси культиватора. Последний устанавливается на специальной механизированной подставке в термостатированном помещении. В рабочем положении цилиндрический культиватор медленно вращается вокруг продольной оси.
