MedUniver Микробиология
  Домой Медицинский фото атлас Психология отношений Медицинские видео ролики Медицинская библиотека Консультация врача  
Микробиология:
Общая микробиология
Общая бактериология
Экология микробов
Учение об инфекции
Лечение инфекций
Иммунология
Методы диагностики
Грам "+" бактерии
Грам "-" бактерии
Микобактерии
Хламидии. Риккетсии
Спирохеты. Трепонемы
Вирусы
Грибы
Простейшие
Гельминтозы
Санитарная микробиология
Книги по микробиологии
Рекомендуем:
Необходимое:
Книги по медицине
Видео по медицине
Фотографии по медицине
Консультации врачей
Форум
 

Температурный режим культивирования вирусов. Накопление вируса в среде.

Температурные границы и температурный оптимум размножения вирусов контролируется вирусным геномом, хотя в известной степени они зависят и от клеточной системы. Принято считать, что оптимальная температура для размножения большинства вирусов 36—37°С. Однако из этого правила имеются исключения. Например, для риновирусов температурный оптимум размножения равен 33—34°С. Герпесвирус 2 крупного рогатого скота максимально накапливается в первичной культуре клеток телят при 32°С. Вирус гриппа С, в отличие от вирусов гриппа А и В, лучше размножается при 32—33°С, хотя накапливается медленнее. Ряд альфавирусов накапливается в постоянной линии клеток комаров при 34,5°С в значительно большем титре, чем при оптимальной температуре, требующейся для размножения этих клеток.

Оптимальный температурный режим размножения вируса может зависеть от температуры предшествующего выращивания. Известно, например, что так называемые «холодные» варианты вирусов лучше размножаются при пониженных температурах, а оптимум размножения у аттенуированных штаммов, как правило, ниже, чем у патогенных штаммов того же вируса.

Накопление вируса в культуре зависит от множественности заражения, которая главным образом влияет на продолжительность накопления вируса, а не на его урожай. Для заражения однослойных культур с целью накопления вируса обычно применяют 0,001-0,1 ТЦД50 на одну клетку (М = 0,001—0,1). При этом накопление вируса в культуре является суммарным результатом многоцикловой репродукции. В случаях, когда имеют дело с культурами клеток, жизнеспособность которых снижается быстро, а вирусы не обладают коротким циклом репродукции, множественность заражения имеет более важное значение. Эти культуры заражают таким образом, чтобы как можно больше клеток включить в первичный инфекционный процесс. Имеются сообщения о повышении урожая вирусов при использовании высокой множественности заражения (М= 10—100). Кроме того, использование высокой множественности заражения способствовало получению «раннего» вируса везикулярного стоматита (спустя 4,5 ч после заражения), с повышенным содержанием вирионного белка, ответственного за иммуногенную активность. Однако высокая множественность заражения в процессе серийного пассирования может привести к изменению соотношения гетерогенных частиц в вирусной популяции и, тем самым, изменить ее фенотипические свойства.

температура культивирования вирусов

В случаях, когда при высокой множественности заражения наблюдается торможение репродукции вируса за счет аутоинтерференции (феномен Магнуса), прибегают к удалению дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ) или других ингибирующих субстанций. Применительно к безоболочечным вирусам хорошие результаты получают с помощью простой обработки вирусного инокулята фреоном или хлороформом.

При медленном накоплении вируса и невозможности обеспечения высокой множественности заражения вирус часто вносят в культуру одновременно с посевом клеток.
Иногда с целью повышения выхода применяют повторные сборы вируса путем смены среды в период выраженного накопления. Этот прием особенно эффективен при культивировании постоянных клеточных линий, хронически инфицированных вирусом (например ВЛ КРС) и экскретирующим его в культуральную среду. Кроме сохранения зрелого внеклеточного вируса, такая операция может способствовать его репродукции за счет уменьшения концентрации ингибиторов в культуре. Заметное влияние на репродукцию вирусов оказывает рН поддерживающей среды. Так, вирус бешенства гораздо интенсивнее размножался в культуре клеток КЭ при повышении рН поддерживающей среды от 7,4 до 8,2. Как показало изучение структуры вирусной популяции, при щелочном рН не происходит накопления ДИЧ и отсутствует аутоинтерференция.

Репродукция альфавирусов также заметно усиливалась при инкубации зараженных клеточных культур в щелочной среде с рН 7,5—7,9. Имеется ряд сообщений о благоприятном влиянии трипсина на размножение некоторых вирусов и проявлении их свойств. Феномен протеолитической активации хорошо известен у орто- и парамиксовирусов. Вирусы гриппа, выращенные в курином эмбрионе, обладали высокой инфекционностью. У тех же вирусов, выращенных в культуре клеток куриного эмбриона, инфекционность была на 2—3 lg ниже. Это явление связывают с протеолитическим расщеплением полипептида гемагглютинина (ГА). Аллантоисный вирус содержит «расщепленный» ГА (ГА1— 50 кД и ГА2—30 кД), тогда как культуральный вирус - «нерасщепленный» ГА (75 кД). Вирионы с нерасщепленным ГА адсорбировались, но не проникали в клетки, поскольку содержали белок (F) слияния оболочки вируса с клеточной мембраной в неактивированной, форме. Оказалось, что расщепление ГА-предшественника на фрагменты ГА1 и ГА2 могут вызывать различные протеазы, однако только расщепление трипсином и трипсиноподобными ферментами приводит к образованию высокоинфекционного вируса гриппа. Обработка вируса гриппа А трипсином до заражения клеток и добавление трипсина в культуральную среду в процессе репликации повышали его инфекционность. Исключение составил вирус гриппа птиц, у которого отмечено расщепление ГА и высокая степень инфекционности как после размножения в эмбрионах, так и в культуре клеток. Обработка трипсином в этом случае не оказывала положительного эффекта.

Вирус Сендай не продуцировал инфекционных частиц в культурах клеточных линий. Обработка инфицированных клеток трипсином восстанавливала его биологическую активность благодаря расщеплению гликопротеина F (65 кД) на две субъединицы FI (51 кД) и F2 (15 кД). Для изоляции и культивирования парамиксовирусов человека весьма эффективной оказалась линия клеток NCI-H292 при использовании поддерживающих сред с добавлением трипсина (1,5 мкг/мл). Установлено, что вирус ньюкаcлской болезни содержит два предшественника гликопротеинов HNo и Fo, которые в результате протеолиза превращаются соответственно в гликопротеины HN и F С ними связана гемолитическая, гемагглютинирующая, нейраминидазная и инфекционная активность вируса. Существенные различия штаммов вируса ньюкаелской болезни по патогенности определяются структурными особенностями гликопротеинов наружной оболочки вириона, которые отличаются способностью активироваться протеолитическими ферментами. Наличие трипсина в поддерживающей среде стимулировало репродукцию вируса осповакцины. Протеолитический процессинг вирусных гликопротеинов зависит от природы вируса, а также от клеточных факторов культуральной системы. В наибольшей степени от протеолитической активизации зависит репродукция оболочечных вирусов, клетками-мишенями которых in vivo являются энтероциты. К таким вирусам прежде всего относятся ротавирусы млекопитающих и птиц, кишечные коронавирусы свиней и некоторые аденовирусы. Классическим примером протеолитической активации могут служить ротавирусы, выделение и культивирование которых стало возможным благодаря применению трипсина.

Обработка трипсином значительно способствует выделению и репродукции вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, и обеспечивает размножение в культуре клеток Vero вируса эпизоотической диареи поросят. Вирус эпизоотической диареи свиней (ВЭДС) размножался в культуре клеток Vero только в присутствии трипсина (10 мкг/мл) в поддерживающей среде. ЦПЭ проявлялся образованием синцития. После ряда пассажей в клетках Vero в присутствии трипсина удалось адаптировать вирус к культурам клеток МА 104, СРК и ESK при добавлении трипсина. Попытка адаптировать вирус к шести типам первичных культур клеток эмбриона свиньи не увенчалась успехом. Использование этой, ставшей теперь рутинной, методики позволило размножить астровирус человека в первичной культуре клеток почки эмбриона человека и обезьян. После 11 пассажей вируса в культуре его размножение оставалось трипсинзависимым. Аналогичным образом удалось адаптировать астровирус крупного рогатого скота (штамм US2, серотипа 2) к размножению в культуре клеток новорожденного теленка. Вирус размножался в серийных пассажах только в присутствии трипсина. На ранних пассажах вирус накапливался в культу-ральной среде через семь суток, а в последующем — через трое. Количество инфицированных клеток в культуре было невысоким и не превышало 10—20%. Значение штамма, клеточного субстрата и протеолитической активации в репродукции вирусов можно проследить на примере ротавирусов птиц и кишечных аденовирусов человека. Ротавирус птиц с трудом культивируется в присутствии трипсина, вызывая ЦПЭ в культуре клеток печени и почек КЭ. После трех пассажей вирус терялся в культуре клеток печени, но полностью адаптировался к клеткам почек.

После шести пассажей вирус приобрел способность реплицироваться без обработки трипсином, а после 10 пассажей в почечных клетках — легко культивировался в печеночных клетках и фибробластах КЭ. Однако размножение ротавируса сопровождалось ЦПЭ только в культуре почечных клеток КЭ. Протеолитическая активация была необходима для выделения и репродукции в культуре клеток KB только некоторых серотипов кишечных аденовирусов человека. Добавление трипсина повышало выход инфекционного вируса гриппа С.
Имеются и другие сообщения о том, что обработка клеток трипсином благоприятно сказывается на размножении ряда вирусов.

- Читать далее "Протеолитическая активация вирусов. Многофакторность размножения вирусов."


Оглавление темы "Методология выращивания вирусов.":
1. Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.
2. Факторы влияющие на размножение вирусов. Размножение вирусов в культуре.
3. Особенности культирования вирусов гепатита. Культивирование вируса гриппа.
4. Культуры диплоидных клеток. Адаптирование вирусов к культуральным средам.
5. Смена вирусной культуральной среды. Изменения вирусов при смене среды.
6. Температурный режим культивирования вирусов. Накопление вируса в среде.
7. Протеолитическая активация вирусов. Многофакторность размножения вирусов.
8. Однослойная культура клеток для вирусов. Размножение вирусов в однослойной культуре.
9. Применение однослойных клеточных культур. Выращивание вируса в однослойной культуре.
10. Выращивание вируса во вращающейся колонне. Культивирование вирусов для производства вакцин.
Загрузка...

   
MedUniver.com
ICQ:493-344-927
E-mail: reklama@meduniver.com
   

Пользователи интересуются:

Будем рады вашим вопросам и отзывам:

Полная версия сайта