Проверка клеточной культуры на контаминацию вирусами. Вирусы контаминирующие клеточные культуры.
Первичные культуры клеток животных проверяют на вирусную контаминацию, используя различные вирусологические, серологические, физические и молекулярно-биологические методы.
Теоретически все вирусы, встречающиеся у данного вида животных, могут загрязнять клеточные культуры, приготовленные из их тканей. Однако на основании практических наблюдений определены наиболее часто встречаемые вирусы, загрязняющие первичные клеточные культуры, а в итоге и культуральные вирусные препараты.
В таблице приведены наиболее вероятные вирусные контаминанты клеточных культур шести видов домашних животных.
Хотя получение исходного клеточного материала от животных, выращенных в контролируемых условиях, — шаг вперед, однако эта мера не является исчерпывающей гарантией чистоты клеточного субстрата. Вирусная контаминация выявлена у многих линий клеток. Клетки ВНК-21 были контаминированы парвовирусом или короноподобным вирусом. Парвовирус обнаружен во многих клеточных линиях. Линия клеток почки поросенка (IBP-2) оказалась персистентно инфицированной авирулентным штаммом вируса классической чумы свиней, который попал в первичную культуру, вероятно, с клетками ранее вакцинированного животного-донора клеток для культивирования. Различные линии клеток почек свиней оказались инфицированными онкорнавирусом типа С.
Частицы онкорнавирусов типа С и В были обнаружены также во многих линиях клеток человека и животных. Практически в каждой постоянной линии клеток можно обнаружить эндогенные ретровирусы или ретровирусоподобные частицы. Однако экспрессия их генетической информации зависит от типа клеток. Потенциальная опасность таких вирусов связана с их сходством с онкогенными ретровирусами. Оценка экспрессии ретровирусов - трудная задача, требующая комплексного решения. В постоянной линии клеток яичника китайского хомяка с встроенным фрагментом ДНК, кодирующим HBs-антиген вируса гепатита В (CHO/HBsAg), обнаружено небольшое количество эндогенных ретровирусо-подобных частиц типа С при отсутствии их биологической активности.
Постоянная линия клеток, полученная из злокачественной лимфомы свиньи, продуцировала ретровирус свиней. В основе системы контроля постоянной линии клеток, исключающей случайную контаминацию при изготовлении вирусных вакцин, лежит создание банка хорошо проконтролированных клеточных линий и расплодок клеток, используемых в производственных целях в течение не более 20 пассажей. Все линии клеток проверяют на бактериальные, грибковые и вирусные загрязнения.
Известно, что сыворотка крови животных является потенциальным источником вирусной контаминации. Особенно хорошо изучена контаминация сыворотки крови крупного рогатого скота. Вирусы довольно часто обнаруживали в сыворотке крови эмбрионов телят и взрослого скота. Наиболее частые контаминанты сыворотки — микоплазмы и вирус диареи крупного рогатого скота.
По этой причине линии клеток различного происхождения оказались хронически инфицированными вирусом диареи крупного рогатого скота. В их числе были перевиваемые клетки крупного рогатого скота (линии MDBK, GBK, BKD, ВК4 и др.), лошадей, свиней, овец, кроликов, кошек и обезьян. Методом иммунофлюоресценции установлено инфицирование вирусом диареи крупного рогатого скота многих культур клеток американской коллекции, полученных от крупного рогатого скота, свиней, обезьян, кошки и москитов. Различные первичные культуры и постоянные линии клеток в некоторых случаях оказались контаминированы полиомавирусом, источником которого была сыворотка инфицированного крупного рогатого скота. У людей, тесно контактировавших с таким скотом, обнаружены специфические антитела.
Вновь приготовленные серии сыворотки крупного рогатого скота обычно контролируют на отсутствие вирусного загрязнения в первичных культурах клеток куриных эмбрионов, почек телят и культуре клеток HeLa. Кроме исследования под микроскопом, культуры проверяют на гемадсорбирующие свойства с эритроцитами человека, кур и морских свинок. С целью повышения эффективности проверки коммерческих партий сыворотки на наличие микоплазмы рекомендована предварительная инкубация проб перед высевом на элективную среду. Образцы сыворотки центрифугировали при 100000 g, осадок ресуспендировали в небольшом объеме среды и вносили в культуры клеток, а также исследовали под электронным микроскопом. Наиболее часто контаминированной оказалась сыворотка крупного рогатого скота (13%). Значительно реже микоплазмы обнаруживают в партиях сыворотки овец (3,2%) и эмбрионов коров (3,1%).
Для стерилизации сыворотки предложена специальная ультрафиолетовая обработка, а также инактивация бетапропиолактоном, которые не ухудшают ее ростовых свойств. Положительные результаты получены при стерилизации сыворотки перуксусной кислотой.
Прогревание сыворотки при температуре 56 °С в течение 30 мин может служить эффективной мерой инактивации микоплазм и некоторых вирусов, присутствующих в ней в качестве контаминантов. Однако при этом снижаются ростовые свойства сыворотки.
Профилактика контаминации сыворотки заключается в тщательном отборе сыворотки и облучении ее гамма-лучами при — 40°С в дозе 2,5—3,5 мегарад. Гамма-облучение эффективно инактивирует и микоплазмы, причем при использовании 10% облученной сыворотки в питательной среде не отмечается нежелательного воздействия на рост клеток или их чувствительность к вирусам. Для сохранения ростовых факторов эмбриональной сыворотки применяют специальные приемы, к числу которых относится сохранение сыворотки в замороженном состоянии до облучения, во время него и после него. Причиной контаминации клеточных культур парвовирусом свиней явились коммерческие партии трипсина Дифко. Сухой трипсин можно деконтаминировать гамма-облучением без потери его протеолитической активности.
В связи с возможностью латентного инфицирования клеточных линий патогенными вирусами, представляющими большую потенциальную опасность, в США введены ограничения на ввоз культивируемых клеток (особенно гибридов). Прежде всего, имеется в виду возможность заноса в страну вируса ящура, источником которого может служить сыворотка, применяемая при культивировании клеток.