Основу лабораторной диагностики ларвального парагонимоза, ввиду отсутствия у больных яиц паразита в выделениях организма, составляют серологические реакции:реакция непрямой гемагглютинации (РИГА), реакция латекс-агглютинации (РЛА) и реакция связывания комплемента (РСК). Для проведения этих исследований на нашем материале использован антиген, приготовленный из взрослых трематод, которые были взяты на 4-5 месяце эксперимента из легких зараженных парагонимозом собак (Г. И. Суханова и соавт., 1984; Г. И. Суханова, С. В. Шитер, 1986).
Приготовление антигена проводилось по Gajolusek (О. Е. Вязов, 1979). Трематоды промывались в стерильном 0,9% растворе хлористого натрия и гомогенизировались в охлажденном до 4°С стерильном 0,9% растворе хлористого натрия в соотношении 1:10. Полученная взвесь центрифугировалась с охлаждением в течение 25 минут при скорости 10000 об./мин., затем надосадочная жидкость диали-зовалась в течение 48 часов при 4°С против дистиллированной воды. Полученный бессолевой фильтрат лио-филизировали и использовали в качестве антигена при постановке реакций. Содержание белка в антигене составляло по Лоури 13-15,8% сухого веса.
РИГА проводилась по методу Л. П. Степанковской (1972). Позже в методике использовались рекомендации Э. Зигля (X. Фримель, 1979): формалинизация эритроцитов в 16,5%) растворе формалина в течение 2-х часов, вместо 16-часовой обработки в 2,5%) растворе, что значительно ускорило изготовление реактива.
Приготовление диагностикума. К 1 объему 5% взвеси формалинизированных и танинизированных эритроцитов прибавляли 4 объема забуференного физраствора с рН 6,4 и 1 объем раствора антигена в изотоническом растворе NaCl. Смесь инкубировали 20 минут при комнатной температуре, затем эритроциты трижды отмывали забуференным физраствором, содержащим 0,2% сывороточного человеческого альбумина, при рН 7,2.
Опытным путем было установлено, что наилучшие результаты получаются при использовании концентрации антигена, равной 0,09 г сухой взвеси на литр. Активность диагностикума возрастает при изменении концентрации от 0,0452 до 0,09 г/л и несколько снижается при ее увеличении от 0,09 до 0,108 г/л.
Ход реакции. Исследуемую сыворотку декомплементировал и прогреванием в течение 30 минут при 56°С, а затем истощали формалинизированными и танинизированными эритроцитами (0,05 мл взвеси на 0,5 мл сыворотки 30 минут при 37°С с последующим удалением эритроцитов центрифугированием). Из надосадочной жидкости готовили ряд последовательных разведений (от 1:10 до 1:5120) в объеме по 0,05 мл, и каждую пробу смешивали с равным объемом диагностикума. Смесь выдерживали 2 часа при комнатной температуре.
Учет результатов реакции проводился по четырехплюсовой системе:
1. Реакция положительная (++++): агглютинированные эритроциты, расположенные по всему дну лунки, образуют сплошную пленку;
2. Реакция положительная (+++): агглютинированные эритроциты, расположенные по всему дну лунки, образуют сплошную пленку, по краям которой заметен ободок из агглютинированных эритроцитов;
3. Реакция положительная (++): агглютинированные эритроциты занимают 2/3 лунки, и по краям виден ободок из агглютинированных эритроцитов;
4. Реакция положительная (+): на дне лунки компактный кружок из неагглютинированных эритроцитов, по краям видны одиночные агглютинированные клетки;
5. Реакция отрицательная: на дне лунки компактный кружок эритроцитов, агглютинированные клетки отсутствуют.
Параллельно с проведением реакции ставился контроль на неспецифическую агглютинацию (с несенси-билизированными бараньими эритроцитами), контроль с раствором альбумина и диагностикумом, контроль с заведомо «положительной» и с заведомо «отрицательной» сыворотками. За диагностический титр принималась РНГА положительная не менее чем на (+++), в разведении не менее чем 1:160.
