Подготовка спермы к внутриматочной инсеминации (ВМИ). Промывание
Методика обработки спермы подразумевает отделение семенной плазмы от жизнеспособных сперматозоидов.
Это необходимо во избежание попадания внутрь матки белков и простагландинов семенной плазмы. Хотя семенная плазма защищает сперматозоиды от неблагоприятных условий, таких как оксидантный стресс, она содержит и факторы, ограничивающие оплодотворяющую способность сперматозоидов, и снижает индукцию капацитации. Подготовка спермы включает быстрое и эффективное удаление семенной плазмы и устранение мертвых сперматозоидов, лейкоцитов, незрелых герминативных клеток, клеток эпителия и микробной контаминации.
В настоящее время применяют несколько методов подготовки спермы.
Идеальный метод подготовки спермы оставляет высокофункциональные сперматозоиды и обогащает качество и функции спермы, не нанося вреда. Метод рентабелен и позволяет обрабатывать большое количество эякулята, что, в свою очередь, максимально увеличивает количество доступных сперматозоидов. Оптимальный метод подготовки спермы минимизирует риск образования свободных радикалов кислорода, способного неблагоприятно отразиться на целостности ДНК и функциональности спермы.
Некоторые методы подготовки спермы сочетают использование метилксантинов и пентоксифиллинов для увеличения подвижности сперматозоидов и повышения оплодотворяющей способности.
Первый шаг при подготовке спермы — проведение анализа эякулята в соответствии со стандартами ВОЗ для определения качества образца перед промыванием. При проведении анализа и подготовки спермы очень важно использовать стерильное оборудование, чтобы свести к минимуму риск ятрогенной внутриматочной инфекции, а также во избежание повреждения спермы, связанного с бактериальным загрязнением.
Техника всплывания спермы
Техника «всплывания» основана на активном самопроизвольном перемещении подвижных сперматозоидов в промывающей среде. Всплывание сперматозоидов из эякулята позволяет избежать центрифугирования, которое может повлечь за собой повреждение спермы активными формами кислорода. Однако данная техника применима только для эякулята с высоким содержанием подвижных сперматозоидов, так как процент полученной жизнеспособной спермы зависит от подвижности сперматозоидов.
При применении техники «всплывания» слой промывающей среды аккуратно наносят на образец спермы. Образец инкубируют, пока подвижные сперматозоиды не всплывут из эякулята в среду. Затем промывающую среду аккуратно отделяют от семенной жидкости и используют для ВМИ. Если анализ первого образца семенной жидкости свидетельствует о ее нормальных параметрах, то, как правило, возможно извлечение достаточного количества спермы с подвижностью не менее 90%. Вся процедура длится 2 ч.
Промывание спермы
Промывание спермы — традиционная и, вероятно, простейшая техника. С ее помощью удаляют жидкую часть эякулята, также немного улучшается подвижность сперматозоидов. Образец семенной жидкости суспензируют в промывающей среде, содержащей антибиотики и биологические добавки, в конической центрифужной пробирке. Затем образец центрифугируют таким образом, что все клетки образуют осадок, а излишний раствор аккуратно удаляют. Осадок вновь погружают в промывающую среду, и центрифугирование повторяют.
Последний образец осадка, из которого удалена вся жидкая часть эякулята, вновь погружают в небольшое количество промывающей среды для ВМИ. Вся процедура занимает менее часа.
Центрифугирование спермы
Центрифугирование в градиенте плотности — метод промывания спермы, удаляющий жидкую часть эякулята и отделяющий жизнеспособные сперматозоиды от других веществ, включая мертвые клетки спермы, лейкоциты и бактерии. При использовании данного метода градиент плотности создают наслаиванием суспензий различной концентрации, состоящих из покрытых коллоидной оболочкой частиц кварца (например, Percoll), в конической центрифужной пробирке, причем чем выше слой — тем больше концентрация.
Разведенный образец спермы помещают над верхним слоем, и пробирку центрифугируют. Излишек удаляют из осадка, затем процесс повторяют. То, что в конце концов остается в осадке, вновь растворяют в промывающей среде и используют для ВМИ. Процедура длится около часа.
Фильтрация спермы через стекловолокно
Фильтрация через стекловолокно — еще один метод удаления жидкой части эякулята и отделения жизнеспособной спермы от другого клеточного вещества после промывания. При использовании данной методики образцы спермы сначала суспензируют в промывающей среде и центрифугируют, почти так же, как при промывании спермы. Полученный в итоге осадок снова суспензируют в промывающей среде и помещают на колонках стекловолокон, созданных путем введения стекловолокон в баллон 3-миллиметрового шприца.
Раствор промытого эякулята фильтруется посредством гравитации, а фильтрат собирают для проведения внутриматочной инсеминации (ВМИ).
Какой метод подготовки спермы к инсеминации лучше?
На данный момент не существует единого мнения по поводу оптимального метода подготовки спермы для внутриматочной инсеминации (ВМИ). В общем все методы («всплывание», простое промывание спермы, центрифугирование по градиенту плотности и фильтрация через стекловолокно) эффективно предоставляют образцы спермы, отвечающие требованиям. Однако некоторые методы подготовки лучше подходят для определенных типов образцов. Таким образом, выбор методики следует основывать на характеристиках отдельного образца.
На сегодняшний день чаще всего применяют метод двойного центрифугирования в градиенте плотности и фильтрацию через стекловолокно. Выяснилось, что эти методы увеличивают количество морфологически нормальных сперматозоидов с подвижностью класса А и нормальной конденсацией хроматина в подготовленном образце. Кроме того, данные методы лучше других снижают количество лейкоцитов и сперматозоидов, подвергшихся воздействию свободных радикалов кислорода, в подготовленном образце и обеспечивают минимальное содержание хроматина и аномальной ДНК ядра клетки, а также высокие показатели зрелости ядер.
Одно из исследований показало, что для образцов семенной жидкости с нормальными или близкими к нормальным параметрами методы «всплывания» и градиента плотности приводят к большей частоте наступления беременности, чем промывание, осаждение, методы замораживания/гепаринизации. Для образцов спермы с низкими показателями оптимальны центрифугирование в градиенте плотности и фильтрация через стекловолокно. В случае крайне малого количества спермы простое промывание повышает количество сперматозоидов, как подвижных, так и нежизнеспособных.
