Самый распространенный метод сбора спермы для анализа, применяемый здоровыми мужчинами, — мастурбация. Но при наличии у мужчины эякуляторной дисфункции или азооспермии нужны иные методы сбора для оценки фертильности или терапевтических манипуляций. Мужчинам, неспособным к эякуляции, может потребоваться клинический сбор спермы; при азооспермии необходимо хирургическое вмешательство.
Обработка эякулята, полученного путем мастурбации. Нахождение сперматозоидов в семенной жидкости приводит к снижению их подвижности и жизнеспособности, а длительная экспозиция неизбежно снижает потенциал фертильности сперматозоидов. Для получения наилучшего образца для лабораторного тестирования функциональности, а также для клинического применения необходимо после эякуляции отделить сперматозоиды от семенной жидкости.
Существует три фундаментальных подхода к отделению плазмы: промывание спермы; миграция сперматозоидов, или «всплывание»; разделение по градиенту плотности. Эти методы обработки спермы применимы как для ВМИ, так и для ЭКО.
Промывание спермы. Промывание — самый распространенный метод отделения сперматозоидов от семенной плазмы. Оно не только быстро и эффективно устраняет вредные плазматические факторы, но и концентрирует сперматозоиды в эякуляте. Промывание спермы выполняют путем смешивания эякулята с соответствующей белковой средой. Затем смесь центрифугируют, и на дне контейнера формируется осадок из сперматозоидов.
Надосадочную жидкость осторожно аспирируют, а осадок ресуспендируют. Проводить процедуру рекомендуют, если концентрация подвижных сперматозоидов в образце высока, а примесей чужеродных клеток мало.
Техника миграции сперматозоидов (метод «всплывания»). В репродуктивном тракте женщины некоторое количество потенциально функциональных сперматозоидов изолируется, попадая в периовуляторную шеечную слизь. Простое промывание удаляет семенную плазму из образца, но не помогает сперматозоидам достичь цели. Методы, обогащающие образец подвижными и морфологически нормальными сперматозоидами, можно применять при ВМИ или ЭКО. К таким методам относится классическая техника «всплывания».
При процедуре «всплывания» используют природную способность подвижных сперматозоидов двигаться против гравитации.
Обычно применяют два различных варианта метода разделения «всплыванием»:
• В первом варианте («всплывание» из спермы) разжиженную сперму разделяют на несколько частей и помещают в пробирки под слой культуральной среды с низкой степенью вязкости.
• Во втором варианте («всплывание» из осадка) свежую сперму сначала промывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, а на осадок аккуратно наносят слой среды.
В обоих случаях подвижные сперматозоиды перемещаются из нижнего слоя (свежая сперма или осадок сперматозоидов) в верхний слой культуральной среды во время инкубации при 37 °С.
Промывание образца спермы перед обогащением подвижными сперматозоидами («всплывание» из осадка) подверглось критике, так как мертвые или аномальные сперматозоиды, имеющиеся в первоначальном образце, остаются в осадке. Aitken и Clarkson выявили, что функциональная способность подвижных сперматозоидов, выделенных из осадка, может быть хуже, чем у подвижных сперматозоидов, изолированных перед промыванием и центрифугированием.
Авторы выдвигают предположение, что образование свободных радикалов кислорода аномальными сперматозоидами в осадке может привести к клеточным повреждениям подвижных сперматозоидов и нарушениям функционирования. Кроме того, осадок после центрифугирования обладает сравнительно малой площадью соприкосновения с верхним слоем, что затрудняет проникновение в среду подвижных сперматозоидов со дна.
Отделение сперматозоидов с помощью градиента плотности. Метод основан на центрифугировании сперматозоидов в градиенте плотности для разделения их фракций по подвижности, размеру и плотности. Были описаны различные методы, использующие прерывистый и непрерывный градиенты (отдельные слои, чередующиеся с определенными поверхностями). Применяют множество коммерчески доступных градиентных материалов. Определенное количество образца спермы осторожно наслаивают на градиент и центрифугируют.
Полученный осадок промывают культуральной средой перед ресуспендированием в среде до получения желаемой концентрации. Кроме того, можно осуществить разделение по градиенту плотности и промывание, а затем «всплывание» сперматозоидов в среде, содержащей буферный раствор бикарбоната, при 37 С в инкубаторе с углекислым газом и получить при этом сперматозоиды с высокой степенью подвижности для ЭКО.
