Криоконсервация гамет и эмбрионов максимально увеличивает успешность зачатия при любом цикле ЭКО и предотвращает утрату образцов. В настоящее время замораживание эмбрионов считают незаменимой технологией в большинстве лабораторий вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Важность криоконсервации была подтверждена комиссией по этическим нормам ASRM. Утверждают, что эффективная программа криоконсервации может снизить вероятность многоплодной беременности, расходы, необходимость применения стимуляции гормонами в дополнительных циклах, а также предотвратить утрату эмбриона.
Однако важно осознавать, что существуют этические, религиозные, правовые и социальные аспекты замораживания эмбриона. В некоторых странах, например в Италии, Германии, Австрии, Швейцарии, Дании и Швеции, криоконсервация эмбрионов строго запрещена.
Для успешной криоконсервации необходимы криопротекторы — химические вещества, которые при добавлении в криоконсервирующую среду защищают клетки от повреждений во время охлаждения, хранения или размораживания. Криопротекторы бывают двух категорий: проникающие и непроникающие (исходя из способности проникать в клеточную мембрану).
Проникающие криопротекторы традиционно обладают низкой молекулярной массой, которая понижает температуру замерзания; в их числе глицерол, этиленгликоль, пропиленгликоль и диметилсульфоксид.
Непроникающие криопротекторы используют при осмотическом сжатии клеток перед заморозкой, они контролируют регидратацию при размораживании. Таким образом, непроникающие криопротекторы (обычно моносахариды или дисахариды) очень важны для смягчения потенциально вредного воздействия «осмотического шока» при замораживании и размораживании. Сахароза служит самым распространенным непроникающим криопротектором.
Повреждения в процессе криоконсервации могут возникнуть в результате криофакторов, например длительного воздействия токсичных криопротекторов, образования кристаллов льда или осмотического шока при заморозке. На данный момент существует две основные категории стратегий криоконсервации гамет/эмбрионов: медленная заморозка и витрификация.
Медленная заморозка при криоконсервации. В настоящее время наиболее популярны методы медленной заморозки эмбрионов. Многочисленные протоколы различаются применением проникающих и непроникающих криопротекторов, а также скоростью заморозки и разморозки. По этим причинам зачастую сложно обобщить или сравнить результаты криоконсервации. Ниже приведен универсальный пример протокола медленной криоконсервации эмбриона в стадии дробления.
Перед криоконсервацией эмбрионы подвергают специфичному для данной программы критерию отбора. После промывания эмбрионов в обрабатывающей среде с добавлением протеина 12-15 мг/мл их погружают в ту же самую среду, содержащую 1,5 моль/л пропиленгликоля (пропандиола), а затем в раствор с содержанием 1,5 моль/л пропиленгликоля и 0,1 моль/л сахарозы. Эмбрионы погружают в пластиковые пробирки или пузырьки и помещают в программируемую криогенную камеру, где они охлаждаются на 2 °С в минуту, начиная с комнатной температуры, до 4 или 6 °С. Через 5 мин термовоздействия охлажденный объект прижимают к стенке контейнера, чтобы индуцировать «сидинг».
Некоторое время эмбрион держат там, затем температуру снижают со скоростью 0,3 °С в минуту до температуры -32 °С. На этом уровне контейнеры погружают в жидкий азот для хранения.
Размораживание происходит при хранении контейнера сначала при комнатной температуре, затем при 37 °С. Эмбрионы извлекают из контейнеров и погружают в размораживающие растворы. Первый раствор обычно содержит чуть большее количество непроникающего криопротектора. Он защищает клетки от «осмотического шока» и разрыва, а также удаляет проникающий криопротектор. Последующие размораживающие растворы содержат сниженные концентрации пропиленгликоля.
Витрификация. Витрификация — форма быстрой заморозки, применяющая очень высокие концентрации криопротектора, таким образом происходит отвердевание без формирования кристаллов льда. Кристаллы льда бывают главной причиной внутриклеточных повреждений в результате заморозки. Термин «витрификация» происходит от латинского слова «vitreous», что означает «стеклянный» или «напоминающий стекло». Витрификацию можно считать модифицированным подходом к криоконсервации, развившимся на основе криоконсервации зародышей млекопитающих.
Таким образом, вещества для замораживания содержат нормальные молекулярные и ионные пропорции первоначального жидкого состояния и могут считаться чрезвычайно вязкими, сверхохлажденными жидкостями. При данном методе ооциты или эмбрионы обезвоживаются путем кратковременного воздействия концентрированного раствора криопротектора перед помещением образцов непосредственно в жидкий азот. Применение витрификации в настоящее время находится в центре внимания многих клинических лабораторий, в которых проводят также исследования на грызунах и домашних животных. С прекрасным обозрением истории витрификации и потенциальных преимуществ можно ознакомиться по этой ссылке.
Независимо от средств криоконсервации, гаметы или зародыши хранят в жидком азоте при температуре 196 С. При таком режиме реакции и процессы, происходящие внутри клеток, приостанавливаются. Таким образом, нельзя определить длительность хранения гамет и зародышей. Существует предположение, что фоновая ионизирующая радиация может нанести вред по прошествии многих сотен лет.
