Современные методы определения опухолеспецифических Т-клеток заслуживают особого внимания. Непрямые методы их обнаружения можно определить как методы, требующие манипуляций in vitro для функциональной оценки Т-клеток, к этим методам относят анализ методом лимитирующих разведений, ELISPOT и внутриклеточное окрашивание на цитокины. В основном, эти методы приводят к занижению числа специфических Т-клеток — либо из-за того, что требуют пролиферации клеток в культуре in vitro, либо из-за того, что они не позволяют оценить функциональную гетерогенность клеток. С другой стороны, доступные в настоящее время прямые методы обнаружения антигенспецифических Т-лимфоцитов, которые могут применяться без использования культур клеток in vitro, имеют крайне ограниченное применение. Такие методы основаны на определении генетически модифицированных трансгенных Т-клеток, которые могут быть использованы только в системах адаптивного переноса реципиентам, или на использовании тетрамерных комплексов молекул МНС с пептидами для подсчета Т-клеток со специфическими рецепторами. Последний метод получил наиболее широкое распространение.
Его принцип основан на том, что Т-клеточные рецепторы специфически взаимодействуют с индивидуальными комплексами молекул МНС с пептидами. Аффинность взаимодействия Т-клеточного рецептора с таким комплексом обычно очень низка — она на несколько порядков ниже аффинности взаимодействия моноклональных антител с антигеном, что не позволяет обнаружить антигенспецифические Т-клетки. Однако аффинность этого взаимодействия можно существенно повысить, если связать несколько молекул МНС в один стрептавидин-биотиновый комплекс. Аффинность взаимодействия такого комплекса с рецепторами Т-клеток становится сопоставимой с аффинностью антител, и после нанесения флуоресцентной метки такие комплексы становится возможным использовать для анализа антигенспепифических популяций Т-клеток методом проточной цитофлуориметрии; возможно совмещение этого метода с внутриклеточным окрашиванием. Существенным ограничением использования рассматриваемого метода является возможность тестирования ответов лишь на отдельные комплексы молекул HLA с пептидами.
Тем не менее, информация, полученная с использованием методов проточной цитофлуориметрии, указывает на существование эндогенных противоопухолевых Т-клеток, миграцию адаптивно перенесенных Т-клеток в опухолевые сайты и экспансию опухолеспецифических Т-клеток после вакцинации некоторыми опухолеассоциированными антигенами. В настоящее время существует острая необходимость расширения использования и оценки этих методов в клинике, что будет способствовать разработке более эффективных методов иммунотерапии рака и правильного отбора пациентов, способных наилучшим образом ответить на такое лечение.
Исследования иммунного ответа на антигены опухолей кожи и, в частности, на антигены меланом принесли львиную долю информации о закономерностях функционирования противоопухолевого иммунитета. Специфическое распознавание и разрушение опухолевых клеток осуществляется специализированной субпопуляцией Т-лимфоцитов — цитотоксическими Т-лимфоцитами CD8+, несущими кло-нальные рецепторы, специфичность которых в распознавании «своего» и «чужого» контролируется процессами внутритимусной селекции. Реальность существования иммунного ответа на антигены опухолей многократно подтверждена в экспериментах, основанных на иммунизации животных сингенными опухолевыми клетками различного происхождения. Работы, нацеленные на идентификацию антигенов опухолей, привели к выявлению двух групп — опухольеспецифических и опухольеассоциированных антигенов. Опухолеспецифические антигены являются истинными антигенами, эффективность иммунн го ответа на которые подтверждается широким рядом экспериментальных работ, однако реальное их применение в иммунотерапии опухолей в клинике является вопросом будущего из-за трудности идентификации таких антигенов у индивидуальных пациентов. Опухольассоциированные антигены являются привлекательной мишенью для разработки иммунотерапевтических подходов к лечению рака в связи с тем, что они с относительно высокой частотой встречаются на различных типах трансформированных клеток. Тем не менее существенным препятствием для их использования является то, что они являются нормальными антигенами нормальных клеток и поэтому иммунная система в той или иной мере толерантна к ним. Эффективность индукции специфического противоопухолевого иммунитета достигается при выполнении трех главных условий:
1) в опухолевой клетке должен быть экспрессирован соответствующий антиген;
2) в репертуаре Т-клеток должны присутствовать клоны, несущие рецепторы, специфичные к комплексу молекулы МНС данного реципиента с пептидом антигена опухолевой клетки;
3) для индукции цитотоксического ответа должен быть обеспечен достаточный уровень костимуляции при взаимодействии Т-лимфоцитов со вспомогательными типами клеток. В соответствии с ними могут быть классифицированы и существующие подходы к иммунотерапии опухолей, нацеленные либо на создание этихусловий, либо на их обход. Для оценки эффективности иммунотерапии создан ряд методов in vitro и in vivo, важнейшими из которых являются методы лимитирующих разведений и ELISPOT, а также прямое определение антигенспецифических Т-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии клеток, окрашенных МНС-тетрамерами.
