Гемоцитометр. Измерение мутности. Неколичественные методы подсчета.
Число бактериальных или дрожжевых клеток в жидкой культуре, например в бульоне, можно прямо подсчитать с помощью микроскопа. Этот метод удобен для подсчета дрожжевых клеток, которые гораздо крупнее бактериальных. При подсчете бактерий необходим объектив с иммерсионным маслом.
Обычно для подсчета используют особое предметное стекло, называемое гемоцитометром, а сам метод известен как гемоцито-метрия. Чтобы обеспечить прочный контакт между предметным стеклом и покровным стеклом, следует сильно придавить покровное стекло с любой стороны камеры (но так, чтобы не раздавить покровное стекло!). Затем покровное стекло слегка сдвигают до тех пор, пока не покажутся цветные линии. Проба жидкости, наносимая пипеткой, затягивается под покровное стекло за счет капиллярного эффекта. Камеру оставляют на 2—3 мин, чтобы клетки осели — это облегчает подсчет. Микроскоп фокусируют на решетке и подсчитывают число клеток на всей решетке, или на ее репрезентативном участке. Нужно насчитать не менее 600 клеток. Если клетки лежат на границе, их можно отнести к квадрату, ограниченному двумя сторонами (например, верхней и правой границами), и не считать их в квадрате, ограниченном двумя другими сторонами, но не следует пытаться считать половинки клеток. Каждый маленький квадрат имеет известную площадь, а глубина жидкости под покровным стеклом является постоянной (обычно 0,02 или 0,1 мм). Следовательно, можно вычислить объем каждой ячейки, и подсчитать число клеток в данном объеме. Если число клеток в каждом квадрате превышает 30, следует развести пробу. Не забывайте при расчетах сделать поправку на разведение.
На решетке, изображенной на рисунке, каждый маленький квадрат имеет размеры 0,05 мм х 0,05 мм = 0,0025 мм2 на общей площади решетки 1 мм2. Если зазор между покровным стеклом и решеткой составляет 0,02 мм, то общий объем над решеткой равен 1 х 0,02 мм = = 0,02 мм3. Можно, следовательно, подсчитать число клеток в данном объеме пробы. Запомните, что 1000 мм3 = 1 см3, а 1000 см3 = 1 дм3 (1л).
При подсчете клеток дрожжей можно использовать краситель метиленовый синий. При этом в синий цвет окрашиваются только мертвые клетки. Живые клетки активно выводят краситель из клетки. Таким образом, можно подсчитать число жизнеспособных клеток, если учитывать только бесцветные или бледно-голубые клетки.
Измерение мутности
Метод, называемый нефелометрией, в принципе прост. Чем больше клеток в суспензии, темвыше ее мутность, или «затемненность», степень которой можно измерить.
Проще всего использовать набор стандартных пробирок (броуновские пробирки), которые имеются в продаже. Они содержат суспензии сульфата бария в различных концентрациях, от прозрачной (пробирка 1) до непрозрачной (пробирка 10). Образец суспензии исследуемых микроорганизмов помещают в идентичную пробирку и подбирают одну из стандартных пробирок, подходящую по мутности суспензии. К набору стандартных пробирок прилагается таблица, позволяющая по мутности рассчитать концентрации клеток для широкого спектра различных микроорганизмов.
Можно также мутность измерять как долю пропускания света (или оптическую плотность) суспензией с использованием колориметра или спектрофотометра. Клеточная масса прямо пропорциональна оптической плотности. Лучше всего использовать красный свет (красный фильтр), поскольку он не интерферирует с желтоватым цветом многих культуральных сред.
При измерении мутности возможны ошибки, если растущие клетки образуют комки (см. раздел, посвященный подсчету жизнеспособных клеток). Наиболее точные результаты получают в тех случаях, когда плотность популяции не слишком высокая и не слишком низкая. Для получения идеальной плотности клеток иногда требуется разведение проб.
Неколичественные методы
Можно использовать и другие методы измерения роста микроорганизмов. Например, у грибов можно измерять рост как увеличение диаметра мицелия с течением времени. Этот метод был бы удобен при изучении влияния температуры на рост грибов, или при изучении действия ингибиторов в среде. Если гриб выращивают в жидкой среде, то можно отфильтровывать или отцентрифугировать пробы культуры через определенные интервалы времени и измерять массу свежего или высушенного мицелия.
