Посев на поверхность агара. Проблемы возникающие при подсчете жизнеспособных клеток.
Иногда важно знать число жизнеспособных клеток. Например, можно оценить эффективность гибели определенных бактерий при пастеризации молока, измеряя количество жизнеспособных бактерий до и после пастеризации. В промышленном производстве только живые клетки участвуют в процессе, поэтому и здесь важно знать число живых клеток в культуре. Количество жизнеспособных клеток можно подсчитывать на чашках, где культура распределена по поверхности агара или внесена в агар; число жизнеспособных клеток дрожжей можно подсчитывать, используя метод гемоцитометрии.
Посев на поверхность агара
Посев на поверхность агара был уже описан в нашей статье. Небольшой известный объем культуры наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри. Недостатком этого метода является то, что часть культуры остается на поверхности шпателя и в пипетке, поэтому невозможно подсчитать число клеток с высокой точностью. Однако часто это бывает не важно.
Метод основан на том, что каждая бактерия через определенный период времени, например через два дня, даст одиночную колонию. Таким образом, число бактерий в исходной добавленной пробе равно числу колоний, выросших после инкубации. Невооруженным глазом различимы только колонии, состоящие из 100 000 и более клеток. Обычно колонии содержат несколько миллионов бактерий.
При условии, что проба содержит не слишком много и не слишком мало бактерий, число колоний можно легко подсчитать, причем для предосторожности лучше не открывать крышку чашки Петри при подсчете. Обычно требуется приготовить серии разведений, так чтобы в одной из серий оказалось идеальное число колоний. Серии разведений — это серии последовательных равномерных разбавлений одного образца. Когда найдено подходящее разведение, эксперимент повторяют при данном разведении для повышения точности и воспроизводимости результатов. В эксперименте 12.3 из разд. 12.9.2 число бактерий в пробах молока было установлено с использованием этого метода. Некоторые ограничения метода обсуждаются в конце данного раздела.
Посев заливкой
Посев заливкой уже был описан в нашей статье. Принципиально он не отличается от посева на поверхность агара, но в данном случае пробу смешивают с питательным агаром перед заливкой чашек, так что колонии распределяются по всему объему среды, а не растут только по поверхности.
Дрожжи
Подсчет жизнеспособных клеток дрожжей можно проводить с помощью гемоцитометра и ме-тиленового синего. Этот метод более детально описан в следующем разделе.
Проблемы, возникающие при подсчете жизнеспособных клеток
С подсчетом жизнеспособных клеток связан ряд проблем.
1. Некоторые бактерии образуют цепочки или группы клеток, например, стрептококки и стафилококки. Каждая группа клеток дает начало только одной колонии. Поэтому иногда результаты подсчета жизнеспособных клеток выражаются не как число бактерий, а как число колониеобразующих единиц.
2. Если присутствует несколько типов бактерий, как, например, в пробах почвы, молока или воды, то условия роста будут не в равной степени благоприятны для каждого типа. Поэтому некоторые бактерии растут гораздо быстрее других, и число видимых колоний будет неадекватно числу бактерий в пробе.
