Темновые реакции протекают в строме хлоропластов, не требуют света и контролируются ферментами. В результате этих реакций происходит восстановление диоксида углерода с использованием энергии (АТФ) и восстанавливающей способности (восстановленный НАДФ), произведенных в ходе световых реакций. Последовательность темновых реакций была определена в США Кальвином, Бенсоном и Бессемом в 1946—1953 годах. За эту работу в 1961 г. Кальвин был удостоен Нобелевской премии.
Схема, показывающая принцип устройства аппарата Кальвина типа «леденец на палочке». Он состоит из тонкого прозрачного сосуда, в котором выращивается культура одноклеточных водорослей. В экспериментах по определению пути, проходимому углеродом в процессе фотосинтеза, через суспензию водорослей продували диоксид углерода, содержащий радиоактивный углерод.
Опыты Кальвина
В своей работе Кальвин использовал изотоп углерода 14С (период полураспада 5570 лет, см. приложение 1), который стал доступен для исследователей только в 1945 г.
Кроме того, Кальвин использовал бумажную хроматографию, которая в то время была относительно новым, но редко применяемым методом. Культуры одноклеточных зеленых водорослей Chlorella выращивали в популярном в настоящее время аппарате, по форме напоминающем леденец на палочке. Культуру хлореллы выдерживали с 14С02 в течение различных промежутков времени, а затем быстро убивали, помещая в горячий метанол. Растворимые продукты фотосинтеза экстрагировали, концентрировали и разделяли при помощи двумерной бумажной хроматографии (рис. 7.16 и приложение 1). Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы проследить маршрут, по которому меченый углерод через ряд промежуточных соединений включается в конечный продукт фотосинтеза.
Идентификация продуктов фотосинтеза в водорослях после короткого периода освещения в присутствии радиоактивного диоксида углерода |4С02. Для разделения продуктов используется бумажная хроматография. Расположение соединений на бумаге позволяет их идентифицировать. Присутствие синтезированных веществ на хроматограмме выявляли при помощи фотопленки. Она темнела там, где находились радиоактивные соединения.
Соединения на хроматограмме обнаруживали при помощи радиоавтографии. Для этого использовалась фотопленка, чувствительная к излучению 14С02 . Фотопленку накладывали на хроматограмму и она темнела там, где находились радиоактивные соединения.
Уже после 1 мин инкубации с 14С02 синтезировались многие сахара и органические кислоты, в том числе аминокислоты. Используя краткосрочные выдержки (в течение 5 с и менее), Кальвину удалось идентифицировать первый продукт фотосинтеза — кислоту, содержащую 3 атома углерода (3С-кислота) — фосфоглицериновую (ФГ). В дальнейшем исследователь определил всю последовательность промежуточных соединений, в которые включается меченый углерод (стадии этого процесса будут рассмотрены ниже). С тех пор последовательность этих реакций носит название цикл Кальвина.