Комбинированная диагностика генных болезней. Биохимические методы в пренатальной диагностике.
В ряде случаев (отсутствие или частичная информативность) ДНК-диагностика некоторых заболеваний может быть дополнена другими диагностическими исследованиями. В случае гемофилии А возможно прямое определение уровня фактора VIII свертывания крови в пуповинной крови плода после 20 нед беременности. ДНК-диагностика адреногенитального синдрома может бьпъ дополнена прямым исследованием содержания 17-ОН прогестерона в амниотической жидкости (АЖ). ПД синдрома ломкой Х-хромосомы нередко дополняют прямым цитогенетическим анализом культуры лимфоцитов пуповинной крови плода, ДНК-диагностика миодистрофии Дюшенна принципиально может быть дополнена иммуноцитохимическим анализом биоптатов скелетных мышц плода.
В случае муковисцидоза дополнительная информация о состоянии плода может быть получена при биохимическом исследовании активности ферментов АЖ в 17-19 нед беременности. Разработанный и широко применяемый в нашей лаборатории алгоритм ПД муковисцидоза приведен на рисунке.
Биохимические методы в пренатальной диагностике
Существенным ограничением биохимических методов в ПД является хорошо известный факт, что о функциональном состоянии того или иного органа плода или системы можно судить только после рождения, когда заканчиваются процессы терминальной дифференцировки клеток специализированных тканей, с одной стороны, и когда прекращается связь плода с материнским организмом, который обеспечивает трофику и основные метаболические процессы плода, - с другой. Этого недостатка лишены рассмотренные ранее цитогенетические и молекулярные методы ПД. Тем не менее биохимические и некоторые другие методы исследования в отдельных случаях оказываются полезными в системе ПД, хотя чаще всего играют вспомогательную роль. Нельзя, однако, исключить, что по мере все более глубокого познания функции генов, втом числе совершенно новых, идентифицированных в процессе выполнения программы «Геном человека», роль биохимических методов в ПД будет возрастать.
Наиболее часто материалом для биохимических исследований в ПД является АЖ, получаемая путем амниоцентеза. АЖ образуется за счет секреторной активности клеток амниона на ранних эмбриональных стадиях развития и за счет первичной мочи плода — в более поздние сроки. Количественный и качественный состав околоплодных вод регулируется компонентами системы амнион - мать - плод; нарушение любого из них приводит к избытку или недостатку вод, влияет на биохимический и клеточный состав АЖ.
Особенности биохимического и клеточного состава АЖ на разных сроках беременности подробно рассмотрены в специальных сводках и обзорах.
Клетки амниотическои жидкости в биохимическом методе
Клетки АЖ используются в ПД не только для цитогенетического анализа, но и для выявления некоторых метаболических болезней, связанных с дефектами обмена веществ. Некультивированные клетки АЖ могут быть использованы для ПД некоторых наследственных дефектов обмена (НДО), когда с помощью гистохимических и электронно-микроскопических методов определяют специфические включения, характерные для ряда болезней накопления. Подобные способы ПД описаны для гликогеноза типа II, До появления ДНК-диагностики культура клеток АЖ долгое время была основным объектом ПД НДО.
Главное условие успешной ПД НДО — точная информация о первичном биохимическом дефекте, лежащем в основе заболевания. Большинство НДО наследуется по аутосомно-рецессивному типу, при котором оба родителя являются гетерозиготными носителями мутантного гена и с вероятностью 25% могут иметь больных детей.
Биохимический скрининг на гетерозиготное носительство для большинства НДО невозможен в связи с отсутствием средних значений концентраций исследуемых белков в норме. Молекулярный скрининг неоправдан экономически, за исключением ряда небольших этнических групп, в которых частота определенных мутаций существенно выше, чем в основной популяции. Примером могут служить ганглиозидоз GM2 типа IV у евреев-ашке-нази, лизосомные болезни типа сиалидо-за и галактосиалидоза, которые чаще встречаются у японцев и итальянцев.
Для точной ПД НДО недостаточно знания клинического диагноза. Даже при хорошо изученных симптомах болезни, например при ряде гликолипидозов и мукополисахаридозов, существуют варианты, обусловленные различными первичными биохимическими дефектами. Примером выраженной биохимической гетерогенности является гликогеноз типа I. Тип I Авызван дефектом глюкозо-6-фосфатазы, в то время как при типах В и С этого заболевания нарушения функционирования фермента обусловлены отсутствием других белков, необходимых для нормального метаболизма глюкозо-6-фосфатазы, а именно специфических транслоказ. При этом активность изучаемого фермента у одного из родителей может быть либо существенно выше, либо ниже среднего уровня и практически не отличаться от уровня, определенного у самого больного. Такая псевдонедостаточность описана, в частности для глобоидной лейкодистрофии.
Подобная вариабельность существенно снижает эффективность ПД биохимическими методами. Для успешной ПД в таких случаях особенно важна информация об экспрессии дефектного белка или фермента в разных тканях. Эта информация и определяет выбор оптимального биологического объекта ПД. Первичный биохимический дефект изучался в разных тканях только для некоторых групп ферментов (например, для лизосомных гидролаз). Кроме того, известно, что активность многих ферментов может варьировать в клетках разных тканей в пре- и постнатальном периодах.
Методы установления биохимического дефекта обычно связаны либо с оценкой активности фермента, либо с выявлением других белков, участвующих в ферментативной реакции, либо с определением продуктов, накапливающихся в результате ферментативного блока. В ряде специальных изданий можно найти подробное описание методов диагностики как давно известных, так и сравнительно недавно разработанных.
Основные наследственные болезни, для которых возможна ПД на основании биохимического исследования клеток АЖ или состава АЖ, приведены в таблице.
Каждой из перечисленных нозологических форм заболеваний соответствует свой первичный биохимический дефект, т.е. нарушение того или иного звена метаболизма, выяснение которого и составляет основную задачу биохимической диагностики.
В связи с быстрым накоплением знаний о геноме человека, идентификацией новых генов, исследованиями их мутаций и полиморфизмов, с одной стороны, сложностью и зачастую неопределенностью биохимических результатов, труднодоступностью специфических субстратов — с другой, диагностика все большего числа наследственных дефектов обмена проводится с использованием более универсальных и точных молекулярных методов анализа. Список НДО, для которых уже разработаны молекулярные методы диагностики, приведен в монографии В.Н. Горбуновой и B.C. Баранова.
Тем не менее некоторые белки АЖ, прежде всего так называемые эмбриоспецифические белки, т.е. белки, характерные только для плода и в норме не синтезирующиеся в организме матери, сохраняют большое диагностическое значение. К таким белкам в первую очередь следует отнести альфафетопротеин (АФП), ацетилхолинэстеразу, белки микроворсинок кишечника плода и стероидные гормоны.
